RPKM与TPM ，you choose who？

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RNA-seq是一种基因表达量测定方法。简单来说，样品中的RNA反转录后进行量测序，将得到的reds比对到参考序列上，来计算基因的表达量。但是，

样品间在数据总量、基因长度、基因数目、高表达基因分布甚至同一个基因的不同转录本分布上都有差别。因此不能直接比较表达量，而是必须将数据进行归一化处理。

丢出两个概念

假阳性率：

重要的评价指标，表达相近的基因被误认为是差异表达的基因

假阴性率：

重要指标，差异表达的基因没有被找出的比例。

差异表达分析原则

所以，RNA-seq找差异表达分析时理应遵循以下几项原则：

1. 样品间没有整体表达量上的差异

2. 正向差异表达与负向差异表达整体趋势相近（正负差异平衡）

3. 在二个样品中表达量相同（无关处理）的基因不应被标记为差异基因（不应出现假阳性）

4. 看家基因可作为表达量评价依据（待定）

RPKM

ok，现在终于进入正题，高出镜率的RPKM，公式如下：

作为最广泛使用的归一化算法，RPKM却有很多弊端：

1. 基因表达平衡问题

   现象：个别表达量很高的基因，会引起其他低表达量的差异假阳性。

   原因：假设2个样品A、B，二者差异表达的只有一个基因，差异量为rDE.由于数据量R相同，B的平均测序深度必将降低。

   则对于某个相同表达的基因g：

   则A的RPKMg=(rg*109)/(flg*R);

   且B的RPKMg =((rg*R/(R+ rDE )*109)/(flg*R);

   二者显然不同（一般认为rDE<<R情况下可以无视)

2. 基因数的影响

   现象：二个样品检测到的基因数不同，会影响RNA-seq结果。

   原因：如样品A表达12000个基因，样品B则表达10000个基因。则只在A中表达的基因2000个必定是差异表达基因（相对B中表达量为0）。但样品总reads不一定A>B，因为其他基因的表达量差异未知。

   如果其他基因的表达量相差不大，则结果如1中情况。

3. 转录本的问题

   现象：两个相同表达的基因呈现差异假阳性

   原因：可变剪接的存在让一个基因存在多个不同的转录本，两个样品中总体相对较短（含有较多的短转录本）的转录本的表达量较少。

   解决方法：

   （一）只统计基因开头的序列READS

   （二）找出reads对基因的覆盖度，并将影响算出

TPM

所以，即然RPKM有这么多弊端，有没有其他参数来替代，当然有!

RPKM的优化版本——TPM

公式是下面这样的，

设Qg = (rg*rl)/flg；则TPM = Qg/∑Qg （ ∑Qg等于上式中的T）

rg：基因g的reads数 ；rl：(总长度∑flg)L/(总reads数)R；

flg：基因的长度。

可知Qg的意义是：

（大部分人看到上面这几个公式都凌乱了，but，你只要记住下面这句话就可以了，学霸除外……）

由此可知，TPM概括了基因的长度、表达量和基因数目。

TPM与RPKM算法比较

对单一人体细胞样本的TPM与RPKM结果数值间的比较

对人不同类型的细胞和鸡细胞样品间

TPM与RPKM结果数值比较

可以看出，对单一的样本，TPM与RPKM的结果基本上是一致的。而对于同一物种不同样本，TPM与RPKM比例f有变化（最多14%），而不同物种间无可比性。

上图描述的是用TPM与RPKM分析两种人体细胞样品的表达量差异，所得结果进行t检验后得到的p值的分布。可以看到，RPKM相对TPM，明显较高P值的差异结果较多。说明RPKM可能引入了人为的表达量差异。

总结：

RPKM及TPM的特点是考虑了基因长度，但是从实验结果看起来，基因长度对RNA-Seq差异比较结果并无极大影响。

从假阳性比较图看来，RPKM与其他算法的差异极大，而且假阳性整体偏高，因其受不同样品表达量影响太大。

（当差异基因所占总体比例提高a(0%-30%)、b(5%-30%)时，各归一化算法与原始数据的a假阳性率和bPOWER变化趋势）

从上图结果可以看出，各算法与原始数据相比，在POWER上均相似，而假阳性率则有较大差别。

最后除了RPKM与TPM还有其他算法， 比如TMM、DESequ、UQ、Med等算法，每种算法都有各自特点。总的来说，没有完美的算法，只有适合与否的算法。嗯。

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