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CRISPR基因编辑技术，自2013年被成功应用于人类细胞以来，就被寄予攻克遗传疾病的厚望，虽然不时有负面新闻出现，但是CRISPR基因编辑还是在疾病治疗领域不断取得突破，也已有多项CRISPR实验开始进入临床试验阶段。CRISPR基因治疗的春天似乎就要到了。 2019年2月18日，最新上线的国际顶级医学期刊 Nature Medicine 杂志同期发表了三篇论文，聚焦CRISPR/Cas9基因编辑在遗传病领域的应用。 这三篇论文使用CRISPR基因编辑技术，在早衰症和杜氏肌营养不良症这两种严重遗传病治疗中取得重大突破。其中两篇各自独立AAV9递送的CRISPR/Cas9基因编辑系统提高了早衰症小鼠约25%的寿命时间。第三篇使证实AAV8递送的CRISPR/Cas9基因编辑系统可以修复杜氏肌营养不良症小鼠，单次注射能稳定长达1年的时间，且期间无毒性作用。 这三项研究分别来自：西班牙奥维耶多大学、美国索尔克生物研究所、美国杜克大学。 早年衰老综合症（Hutchinson-Gilford Progeria syndrome），简称早衰症。属于先天性遗传病，由于LMNA基因发生点突变所致，特点为发育延迟，至婴儿时期就发生进行性老年性退行性改变。患者身体的老化过程十分快速。而罹患此病孩童的年龄很少超过13岁，大约每八百万个新生儿之中就有一到四人患有此疾，目前尚无有效治疗方法。 杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy），简称DMD，是一种X染色体隐性遗传疾病，因此主要在男孩中发病。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者一般在3-5岁开始发病，最早表现出进行性腿部肌无力，导致不便行走。12岁时失去行走能力，20岁-30岁因呼吸衰竭而死亡。 1、为早衰症开发的一种基于CRISPR/Cas9的基因疗 论文题目：Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome. 核结构蛋白lamin A和C是由LMNA基因编码，在早衰症中，LMNA基因发生突变，激活了一个选择性前体mRNA （pre-mRNA）剪接位点，导致表达一种缺失50个氨基酸的lamin A蛋白突变体——progerin，progerin累积于核膜上，Progerin以一种显性方式发挥作用，可导致多种细胞缺陷，损害核结构的完整性、异染色质维持、DNA修复和氧化还原稳态，从而促进细胞衰老。 CRISPR/Cas9基因编辑工具在之前的研究中对杜氏肌营养不良、代谢病以及先天性失明、失聪等疾病产生了非常有希望的疗效。之前的小鼠实验发现，同时有正常lamin A蛋白和突变的progerin蛋白的小鼠表型正常。因此，减少异常剪接导致的progerin蛋白的积累，就有望治愈早衰症。 研究人员开发了针对早衰症的基于CRISPR / Cas9的策略，旨在阻断lamin A蛋白和progerin的积累。LMNA基因通过可变剪接和多腺苷酸化编码lamin C（由外显子1-10编码）和lamin A（由外显子1-12编码）。由于lamin A可有可无的，因此该策略是破坏LMNA基因的最后部分，阻碍laminA / progerin的产生，而不影响lamin C。 该研究使用早衰症小鼠模型，考虑到安全性和广泛的组织亲和性，选择了腺相关病毒9型（AAV9）作为递送载体。每只实验小鼠通过腹腔注射2×10的11次方的AAV9，RT-PCR检测发现progerin的mRNA降低到检测不到的水平，免疫组化实验发现progerin蛋白阳性的细胞显著减少。 重要的是，与对照小鼠相比，经过CRISPR/Cas9治疗的小鼠中的progerin蛋白显著减少，其中位存活时间增加了33.5天，从127天增加到160.5天，这代表了26.4％的寿命增长。最大生存期从151天延长到212天。 2、单剂量CRISPR/Cas9疗法延长了早衰症小鼠的寿命 论文题目：Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome. 该研究的原理和方法与上一项研究类似，靶向基因和位点也相同，同样使用AAV9型递送载体，此处不再赘述。不同之处在于，考虑到早衰症是一种全身性疾病，该研究使用静脉注射方式给药。而且，同时使用双靶点gRNA靶向LMNA基因的11、12号外显子。 从实验结果来看，CRISPR/Cas9基因治疗减缓了早衰症小鼠的体重减轻情况。与对照组小鼠相比，基因治疗组的小鼠中位存活时间从16.7周提高到25.3周，这代表了约25%的寿命延长。 3、对杜氏肌营养不良症的AAV-CRISPR基因组编辑的长期评估 论文题目：Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy. 杜氏肌营养不良症（DMD）是一种发病率相对较高的单基因疾病，由X染色体上编码抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin）突变所致，是治疗性基因组编辑的热门候选者。最近有几个在DMD的临床前模型中进行基因组编辑的研究报道，然而，这些基因组编辑方法的长期持久性和安全性尚未得到解决。 由于dystrophin基因很巨大，有多达79个外显子，因此直接递送正确编码的dystrophin基因的治疗方式行不通。该研究使用CRISPR/Cas9基因编辑，直接删除突变位点附近的碱基，产生缩短版的抗肌萎缩蛋白，依然可以恢复部分肌肉能力。 本项研究显示，通过静脉单次注射AAV8装载的CRISPR后，基因组编辑效果在肌营养不良症的小鼠模型中可持续长达1年的时间。此外，在此期间抗肌萎缩蛋白表达的恢复得以维持。 这项研究还表明AAV-CRISPR在给予成年小鼠治疗时具有免疫原性，然而，通过治疗新生小鼠可以避免体液和细胞免疫反应。尽管存在对Cas9的宿主反应和持续的非预期的基因组修饰，但AAV-CRISPR具有良好的耐受性，长达1年时间，且没有毒性迹象。 关于Cas9的免疫反应，点击查看：波澜再起：人体预先存在对Cas9蛋白的免疫反应 该研究进一步确定了永久性基因校正作为DMD和潜在其他疾病的治疗方法的可行性。未来的研究应侧重于通过优化递送和基因编辑策略来提高整体编辑效率和增加预期基因修饰的比例（减少脱靶效应）。 论文链接： https://www./articles/s41591-018-0338-6 https://www./articles/s41591-019-0343-4 https://www./articles/s41591-019-0344-3 |
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