首篇植物单细胞图谱文章解析 | Plant Physiology：植物根尖单细胞图谱

文章信息

文章题目：Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells

发表期刊：Plant Physiology

发表时间：2019.2

影响因子：5.95

作者：John Schiefelbein

单位：Department of MCDB, University of Michigan

前言

单细胞转录组测序已经广泛应用于医学（动物）研究，可以同时揭示成千上万个细胞特异的基因表达，分析细胞异质性、细胞分化谱系、发现新的细胞类群或疾病发生发展相关细胞群体，极大推进了相关领域的研究进展，因此单细胞测序技术成为最近几年非常热门的研究方向。由于植物细胞外层存在细胞壁，不利于植物细胞分离和捕获，所以单细胞测序技术还没有广泛应用于植物研究领域。虽然以往也有植物单细胞转录组的研究，但主要是利用玻璃毛细管、GFP显微荧光分离、流式细胞仪或显微切割等技术获得一些植物单细胞，细胞通量通常很小，一般只有一两百个细胞，所以目前为止植物领域缺少高通量单细胞转录组的研究。

2019年2月4日，美国密歇根大学John Schiefelbein实验室在Plant Physiology杂志发表了题为“Single-Cell RNA Sequencing Resolves Molecular Relationships Among Individual Plant Cells”的研究论文。该研究对拟南芥根组织原生质体进行了高通量单细胞转录组测序，证实高通量单细胞测序在植物研究中的可行性和有效性。

结果

作者对200个拟南芥（Col-0）幼苗根尖组织进行解离并制备了约1万个原生质体，利用10X Genomics Chromium单细胞测序平台，获得了共7552个单细胞的转录组数据（包含3个生物学重复）。平均每个细胞测序数据量是75,000 reads，平均每个细胞检测到约24,000个转录本（UMIs）和5000个基因，所有细胞群体中共检测到超过22,000个基因。

tSNE聚类分析结果表明，3个野生型植株细胞高度重现，不同重复之间的细胞均匀混合，证明本次实验具有较高的可重复性。

利用Seurat进行无监督聚类，所有细胞可以聚类成9个主要的细胞类群（下图C）。通过对差异基因分析（FC ≥2&FDR≤0.05）、GO富集分析以及86个已知根组织细胞特异性maker基因的表达情况，作者划分了单细胞类群，发现不同亚群细胞表达组织特异性基因，相应的细胞群体分为：根毛（生毛细胞）表皮细胞（亚群4、8）、中柱细胞（亚群0、5）、非根毛表皮细胞（亚群3）、皮层（亚群6）、内皮层（亚群7）、分生组织内皮层（亚群2）和根冠（亚群1）（下图D）。

中柱细胞群体（亚群0、5）包含多种细胞类型且存在多个可用的细胞marker基因，作者利用木质部和韧皮部marker基因区分了中柱细胞内的不同细胞亚簇，并进一步区分得到不同的细胞类型（下图A、B），包括原生韧皮部筛管细胞、韧皮部伴细胞、原生木质部细胞，这些数据表明单细胞转录组数据可以从异质性的组织或器官中鉴定出稀有细胞。

有些基因在同一个细胞类群的不同细胞中表达存在差异，已知SCARECROW (SCR)主要在近地面组织细胞聚类中表达，而UPBEAT (UBP1) 主要表达于分化根细胞的伸长期，但两个基因在不同细胞群体中的不同细胞间也表现出不同表达模式（下图A、B）。为了更全面地分析这一点，作者从以前的根转录组数据中提取在分生组织区和分化区优先表达的基因，在每个细胞群体的每个细胞计算分生基因VS分化基因表达比值，发现大部分未成熟细胞（分生组织）定位在tSNE聚类图谱的中心，而成熟细胞从这个中心向外发散（下图C），表明单个集群内的细胞主要由它们的分化状态决定。

为了评估利用单细胞转录组研究根细胞分化的可行性，作者选取了表皮组织数据分析根毛细胞和非毛细胞的分化。作者提取了包含表皮组织和根冠组织的4个细胞群体（1、3、4、8）进行了重新聚类，获得了11个小的聚类（下图A）。通过分析细胞聚类间的差异表达基因和43个表皮和根冠maker基因的表达（下图B），11个聚簇划分为根毛细胞（1、2、3）、非毛细胞（0、8、9）、小柱根冠细胞（10）和分生干细胞（7），侧根冠细胞由于缺少特别的marker基因暂时归到4、5、6群体。

在根毛细胞（1、2、3）和非根毛细胞类群（0、8、9）中分别进行150个根毛基因（下图C）和52个非根毛基因（下图D）表达谱分析，这些基因在这些细胞不同分化阶段表现出不同表达模式，因此定义2、1、3细胞群体分别是根毛细胞分化时的早-中-晚期细胞，9、0、8细胞群体分别是非根毛细胞分化时的早-中-晚期细胞。

细胞亚群7连接了发育早期的根毛（2）和非根毛细胞（9），表明两种表皮细胞可能共同起源于细胞亚群7。拟时序分析（Monocle2）表明分化轨迹由细胞亚群7依次向早中晚期根毛细胞（2、1、3）（下图E）、早中晚期非根毛细胞（9、0、8）（下图F）跃进；使用Destiny构建了根毛细胞聚类、非根毛细胞聚类和细胞亚群7之间的扩散图谱，得到与Monocle2一致的结果（下图G）。最后作者分析根毛细胞分化早期marker基因（MYC1, EGL3, and RHD6）以及非根毛细胞分化早期marker基因(TTG2, GL2, and ETC1)的表达累积情况，发现表达这些基因的细胞来自于细胞亚群7（下图H），表明细胞亚群7含有分生组织干细胞，它产生分化表皮细胞的两个分支。

为了进一步探讨表皮细胞的起源，作者分析了细胞亚群7中每个细胞表达根毛细胞调控基因（MYC1, EGL3, and RHD6）以及非根毛细胞调控基因(TTG2, GL2, and ETC1)的表达情况，发现细胞亚群7中有10%的细胞存在两类细胞决定基因的共表达（下图A），表明这些细胞可能是表皮细胞系的起源细胞。

静止中心(quiescent center,QC)细胞在根分生组织中与根表皮干细胞相邻,作者为了探索QC细胞是否存在于细胞亚群7中，分析了52个QC细胞marker基因，发现细胞亚群7下部有一个相对较小的细胞群表达相关基因（下图B）。通过聚合这一小群体细胞中QC细胞marker基因表达数据，作者发现了高表达QC细胞marker基因的23个细胞，并发现相关基因在两个细胞表达最高（下图C），且这两个细胞不表达早期表皮细胞marker基因，因此作者将两个细胞指定为假定的QC细胞。通过比较这两个细胞和其他21个细胞基因表达情况，发现了优先在QC细胞表达的基因，包括三个PIN形成 (PIN)基因和三个根分生组织生长因子（ROOT MERISTEM GROWTH FACTOR ，RGF)基因，其中有6个基因只在QC细胞表达，包括PLP6（下图D）。

作者对rhd6（根毛细胞缺陷）和gl2（非毛细胞缺陷）两种突变体的根组织也进行了scRNA-seq，和野生型的数据进行整合后所有细胞聚类成12个群体，利用已知的86个marker基因，将12个细胞群体进行了细胞类型分配（下图A、B）。

相比野生型，rhd6突变体根毛细胞的比例显著减少，而gl2突变体非毛细胞的比例也显著减少，同时大部分的maker基因表达也相应消失（下图C）。值得注意的是，作者发现rhd6和gl2突变体表皮细胞中仍然分别有根毛和非毛细胞maker基因的表达（下图D），表明这些突变体并没有完全阻断相应细胞的分化。

参考文献

Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., & Schiefelbein, J. (2019). Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiology, pp.01482.2018. doi:10.1104/pp.18.01482