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在近十年的生物科研界，RNA可是个引领潮流的“弄潮儿”，mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA,吸引着无数科研狗们前仆后继，可谓是火的一塌糊涂。打开pubmed,随便搜几篇RNA的文章，几乎每篇都有RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)的身影，然而受限于实验仪器，技术或者经费的影响，对于一些童鞋来说，RNA-FISH始终如那海市蜃楼一样，可望而不可即。没关系，今天科研狗小张带你手把手做RNA-FISH！ 图片来源：网络 首先介绍原理，利用核酸分子的碱基互补配对原则，将人工设计的外源核酸片段（即探针）与细胞中的待测RNA互补配对，经变性-退火-复性，即可形成靶核酸与核酸探针的杂交体，在荧光检测体系下对RNA进行定位，定性或半定量分析。 闲话少说，具体的实验流程奉上！ 1.铺细胞于共聚焦小皿中，细胞融合度30%-50%开始实验； 2.弃去培养基，1x PBS静置清洗三次，5min/次； 3.FISH试剂盒-20度取出，平衡至室温； 4.4%多聚甲醛室温固定10min,配通透液4度预冷；（通透液：0.5%的TritonX-100 PBS溶液） 5.1xPBS清洗三次，5min/次； 6.1ml/孔预冷的通透液，4度静置5min； 7.1xPBS清洗三次，5min/次； 8.200ul/孔预杂交液，37度封闭30min；（预杂交液：Blocking Solution:Pre-hybridization=1:99,37度孵育至透明澄清后分装保存） 9.杂交液37度预热； 10.避光，5ul探针加入200ul杂交液中； 11.弃去预杂交液，200ul/孔加入含探针的杂交液，避光，37度杂交过夜；（加入杂交液时避免起泡） 12.提前配好杂交洗液1、2、3，42度预热；（杂交洗液1、2、3分别为4x、2x、1x的SSC溶液。可先配置20xSSC,方法为8.765g NaCl+4.41g柠檬酸钠→50mldd水，调PH值至7.0，再逐步稀释） 13.避光，42度杂交洗液1清洗三次，5min/次； 14.避光，42度杂交洗液2清洗两次，5min/次； 15.避光，42度杂交洗液3清洗一次，5min/次； 16.避光，1xPBS室温5min； 17.避光，100xDAPI用1x PBS稀释成1x PBS,100ul/孔，染色10min； 18.避光，1xPBS清洗三次，5min/次； 19.共聚焦显微镜拍照，Image Pro Plus处理数据。 注意： 1. 本实验前后需大概总需22次清洗，手法务必轻微，不要把细胞洗掉,如果感觉细胞贴壁能力不强，可提前在小皿中铺入0.2%的明胶增加细胞贴附力； 2. 第十步以后，操作需避光，防止曝光。 |
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