Plus深读 | 在小鼠中SETDB1介导减数分裂中DNA损伤响应引起的性染色体沉默

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https://www./developmental-cell/fulltext/S1534-5807(18)30825-6

染色体联会或重组紊乱会引起后代的突变和非整倍性。为避免后代出现上述情况，监测机制会在减数分裂前期I会清除这些缺陷的生殖细胞。目前，这类监测机制在小鼠中存在两种：1）持续的DNA损伤激活CHK2/p53/p63通路清除生殖细胞；2）在缺少持续的DNA损伤情况下，减数分裂时同源染色体不联会同样会引起生殖细胞的清除。在减数分裂的粗线期，同源染色体不联会会引起减数分裂性沉默，是一种兆级染色体重塑过程，使数百个基因失活¹。此外，在雄性减数分裂过程中，减数分裂性沉默引起未联会的XY染色体区域被抑制，最终形成浓缩的XY小体²。减数分裂性沉默依赖于DNA损伤响应（DNA damage response，DDR）网络，但是并不清楚DDR蛋白如何参与抑制性染色体标记的形成。在本研究中，研究工作者发现组蛋白H3-K9甲基转移酶SETDB1在雄性小鼠中作为连接DDR与减数分裂性沉默的桥梁：在沉默开始时，X染色体中DDR网络的下游形成H3K9me3；在缺少SETDB1时，X染色体积累DDR蛋白而非H3K9me3；最终，性染色重构，沉默失败，生殖细胞凋亡。此外，本文研究数据表明TRIM28连接SETDB1和DDR蛋白，具有潜在的减数分裂-XY沉默功能。该研究工作者还发现SETDB1能适时调控减数分裂以及减数分裂后基因的表达。因此，SETDB1将DDR网络、染色体不联会和减数分裂染色体沉默联系起来。

一知识积累

1，  SYCP3：属于Cor1基因家族，其编码的蛋白为DNA结合蛋白，主要表达在初级精母细胞中，参与第一次减数分裂偶线期同源染色体配对过程中联会体复合物的形成，可用于标记染色体轴向元件。

2，  减数分裂性染色体失活（Meiotic sex chromosome inactivation，MSCI）：发生在雄性减数分裂过程中，影响大多数或所有XY基因表达并导致形成浓缩的XY小体，MSCI的紊乱导致毒性基因错误表达和中粗线期生殖细胞死亡。如图1A，减数分裂性沉默起始于未联会染色体轴向上重组的DNA双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）位点，然后，SYCP3、HORMAD1/2和BRCA1-A以及ATR富集在DSBs位点，接着它们沿着未联会的染色体轴向移动，随后，在MDC1和TOPBP1的协助下，ATR进入染色质环，催化H2AX的第139位丝氨酸磷酸化（γH2AX）。

3，  Ngn3-Cre：表达于胃肠道和胰腺以及出生后7天的雄性生殖细胞中，已被应用于减数分裂敲除Topbp1和Atr等基因^{3, 4}。

4，  PARP（poly ADP-ribose polymerase）：是DNA修复酶，定位在细胞核内，在体内是Caspase 3的主要剪切对象，在细胞凋亡的研究中，剪切的PARP可作为凋亡的标志。

5，  CBX1：也称异染色质蛋白1β，直接结合H3K9me3，在异染色质形成过程中促进H3K9me3延伸；

6，  USP7：一种去泛素化酶，能被SCML2招募调控H2A去泛素化⁵，协助建立雄性生殖细胞的表观基因组；

二实验结果

1，  DDR蛋白指导粗线期X染色体上H3K9me3的获得

如图1B，在粗线期早期，H3K9me3富集在XY二价染色体上，同时也富集在着丝粒周围异染色质。为检测减数分裂性沉默相关蛋白是否与XY相关的H3K9me3有关，研究工作者在Hormad2敲除（Hormad2 KOs）、Brca1第11位外显子敲除突变（Brca1^Δ11）、Atr敲除（Atr cKOs）以及H2afx敲除（H2afx KOs）条件下分析了性染色体上H3K9me3的模式，如图1C、1D、1E和1F，在X染色体上并未发现H3K9me3的富集，因此，X染色体上H3K9me3的富集位于DDR蛋白因子的下游。研究工作者对Hormad2 KOs 和 Brca1^Δ11突变深入分析发现，这些突变中存在另外一个表型：如图1C和1D，正常定位在X染色体的Atr错误地出现在未联会的常染色体（Atr诱导形成γH2AX）；富集γH2AX的区域同样存在H3K9me3的富集，提示γH2AX和H3K9me3在空间上紧密相关。

图1 DNA损伤响应因子指导X染色体上H3K9me3形成

2，  减数分裂Setdb1敲除引起中线期细胞凋亡

为确定H3K9me3甲基转移酶，研究工作者分析了已经发表的小鼠精子形成中的RNA测序数据⁶，如图2A，Setdb1在H3K9me3甲基转移酶中因其高表达而引起关注，免疫荧光显示，在粗线期早期，SETDB1与配对的XY染色体存在共定位（图2B），睾丸的免疫共沉淀证明SETDB1与γH2AX形成复合体（图2C）。在小鼠中，敲除SETDB1导致胚胎致死⁷，而在早期生殖细胞中，条件性敲除Setdb1引起精子形成停滞在减数分裂前。因此，研究工作者认为敲除Setdb1的最佳时间应在精子形成后期和粗线期之前。

图2 敲除Setdb1诱导细胞凋亡

为实现减数分裂的Setdb1敲除，研究工作者构建了携带Ngn3-Cre的Setdb1^flox/-雄性Setdb1 cKO小鼠，如图2D，Setdb1 cKO突变删除了SET结构域的核心氨基酸，并加上了报告基因EYFP；如图2E，Ngn3-Cre在精原细胞中是激活的而在睾丸的体细胞中并未激活；如图2F，与Setdb1对照雄性小鼠（Setdb1^flox/+; Ngn3-Cre）相比，敲除Setdb1显著降低睾丸重量，但是并不影响小鼠的整体体重；如图2G，Setdb1敲除鼠的睾丸中Setdb1的蛋白显著降低，这一结果也被免疫荧光确定（图2H）；在Setdb1 cKO雄性小鼠中，生殖细胞进展至IV期未受影响，相当于减数分裂的粗线期中期，此时，生殖细胞发育完全受阻（图2I），随后的精子就不存在了，因此，Setdb1 cKO雄性小鼠的尾附睾中没有精子（图2J）；如图2K，在Setdb1 cKO雄性小鼠的精母细胞中存在较多剪切的PARP（cleaved-PARP，cPARP），提示Setdb1 cKO雄性小鼠中生殖细胞通过细胞凋亡而消失。

3，  敲除Setdb1对减数分裂染色体重组和联会影响较小

中粗线期生殖细胞死亡可能由同源重组、联会和MSCI的缺陷引起。研究工作者首先检测Setdb1 cKO雄性小鼠和对照小鼠中细线期和粗线期早期的减数分裂DSB标记RPA2和RAD51的分布情况，与对照小鼠相比，在细线期，敲除Setdb1并未改变RPA2，轻微降低RAD51（详见补充材料图S3A和S3B）；在粗线期早期，敲除Setdb1轻微增加RPA2，而不影响RAD51（详见补充材料图S3C和S3D）。因此，敲除Setdb1轻微影响这些重组标记的峰度。

图3 SETDB1是XY染色体配对表观重组所必需的

研究工作者进一步评估了Setdb1 cKO雄性小鼠中的联会情况。如图3A，与对照小鼠相比，敲减Setdb1并未影响未联会标记HORMAD2在XY染色体的定位；此外，Setdb1 cKO雄性小鼠中XY染色体和常染色体的未联会情况并非总是一致；有意思的是，Setdb1 cKO雄性小鼠中常染色体未联会的情况只在二价染色体的着丝粒端观察到（100%；n = 27未联会的二价染色体），相反，对照小鼠中常染色体未联会的情况并非只发生在着丝粒端（77%；n=31未联会的二价染色体；p=1.17×10^-2；Fisher精确检测）。为评估与Setdb1敲减相关的着丝粒未联会是否更倾向于影响较小的染色体，研究工作者分别对1号染色体（最大染色体）和19号染色体（最小染色体）进行DNA荧光原位杂交（详见补充材料图S4D），在对照组的精母细胞中，19号染色体的未联会情况比1号染色体更加常见；而在Setdb1敲除鼠中，这两条染色体的未联会情况的发生率都在增加，但是，19号染色体与1号染色体频率比值又与对照小鼠中相似。因此，SETDB1介导的着丝粒联会并非是小染色体特异的。

4，  SETDB1是XY染色体配对表观重组所必需的

考虑到Setdb1对重组和联会的轻微作用，研究工作者决定检测Setdb1 cKO雄性小鼠中MSCI是否受影响。首先，研究工作者聚焦在粗线期早期，沉默因子在XY二价染色体的定位。由于未联会的常染色体数目增加会间接抑制γH2AX在XY染色体配对的积累⁸，研究工作者一开始检测了没有未联会常染色体的细胞，如图3A，在性染色体联会时，SYCP3、HORMAD2、 BRCA1、 ATR、 TOPBP1、 MDC1和γH2AX XY染色体的定位都是正常的，而在性染色体未联会时也是正常的（详见补充材料图S4E）。如图3B，与对照小鼠相比，在Setdb1 cKO雄性小鼠中，着丝粒周围异染色质和Y染色体上H3K9me3的定位并未受影响，但X染色体上H3K9me3却显著降低。

接着，研究工作者进一步评估了敲减Setdb1对其他XY染色体相关因子CBX1、USP7以及多聚泛素化（polyubiquitylation，poly-Ub）的影响，如图3C，CBX1在对照小鼠和Setdb1 cKO雄性小鼠中都存在着丝粒周围异染色质和Y染色体上，但Setdb1 cKO雄性小鼠中X染色体上没有CBX1的富集；此外，与对照小鼠相比，USP7和poly-Ub在Setdb1 cKO雄性小鼠中的XY配对中都显著降低。因此， SETDB1位于DDR通路的下游通过催化H3K9me3参与XY染色体重组。

图4 SETDB1是XY染色体浓缩必需的

5，  SETDB1是XY染色体配对浓缩所必需的

在MSCI过程中，延伸的XY染色体配对会形成XY小体。研究工作者注意到在粗线期早期，Setdb1 cKO雄性小鼠中存在持续延长的XY二价染色体。研究工作者通过对SYCP3、 HORMAD2和着丝粒进行免疫荧光，并测量了XY染色体着丝粒的平均距离。如图4A，在粗线期早期，Setdb1 cKO雄性小鼠中XY染色体的着丝粒平均距离是对照组的2倍以上，提示Setdb1 cKO雄性小鼠中XY小体形成受阻。为确认这一表型，研究工作者分析了对照小鼠和Setdb1 cKO雄性小鼠睾丸中γH2AX标记的XY染色体配对的浓缩状态。如图4B，在对照雄性小鼠中，XY配对在VIII期（晚偶线期）延伸，在I至V期（粗线期的早期至中期）发生浓缩；在Setdb1 cKO雄性小鼠中，XY配对在在VIII期（晚偶线期）延伸，但在I至V期仍保持延伸，直至生殖细胞被清除。因此，SETDB1是XY染色体配对浓缩所必需的。

6，  SETDB1是粗线期XY染色体沉默所必需的

图5 条件性敲除Setdb1导致粗线期精母细胞MSCI缺陷

粗线期XY染色体配对浓缩与性别基因沉默相关¹。为确定敲除Setdb1对XY基因表达的影响，研究工作者通过细胞分选从Setdb1 cKO敲除雄鼠和C57BL6/J雄鼠富集早期至中期的粗线期细胞进行RNA-seq：C57BL6/J雄鼠中平均每百万的XY基因转录本与已发表的数据相似⁶，但是Setdb1 cKO敲除雄鼠中平均每百万的XY基因转录本增多了（详见补充材料S5A），提示在Setdb1 cKO敲除雄鼠中XY基因沉默存在缺陷。接着，研究工作者进行了差异基因分析：在Setdb1 cKO和野生型粗线期细胞中有63%（304/784）个X-蛋白编码基因和38%（29/105）个Y-蛋白编码基因存在差异表达，常染色体上只有9%发生差异表达，其中56.2%基因上调，43.7%基因下调；此外，几乎所有差异表达的XY基因（99.7%X-蛋白编码基因和93.1%蛋白编码基因）在Setdb1 cKO雄鼠呈现高表达（图5A）。如图5B，与野生型小鼠相比，Setdb1 cKO雄鼠中XY染色体上基因表达的中值分别增加3.3倍和3.7倍，常染色体上基因表达的中值没有变化。如图5C，Setdb1 cKO雄鼠中上调的基因分布于整条X染色体，但却分布于Y染色体的一端。为确定RNA-seq数据，研究工作者通过RNA-FISH分别检测了X基因Scml2和Y基因Zfy2的表达情况，如图5D，与野生型小鼠的早期粗线期细胞相比，Setdb1 cKO雄鼠中早期粗线期细胞中Scml2和Zfy2表达显著升高，这一表达模式与MCSI突变相似³。因此，Setdb1对于MSCI至关重要。

基于免疫荧光分析（图3B），研究工作者假设Setdb1通过催化X基因处H3K9me3的形成介导基因沉默。研究工作者对Setdb1 cKO敲除雄鼠和C57BL6/J雄鼠中的早期至中期的粗线期细胞进行了ChIP-seq以确定H3K9me3在所有基因的分布情况：在两种基因型小鼠中，H3K9me3在常染色体的分布相似；然而，与野生型雄鼠相比，Setdb1 cKO敲除雄鼠中H3K9me3在XY染色体的分布显著降低（图5E），因此，敲除Setdb1在染色体水平降低XY基因的H3K9me3。如图5F，研究工作者对Setdb1 cKO敲除雄鼠中抑制标记H3K9me3缺失的上调基因进行了GO分析，排名最高的是精原细胞发育，而在Setdb1 cKO敲除雄鼠中下调基因的GO分析显示，排名靠前的是减数分裂。这些结果提示Setdb1调控精子生成基因的时空表达，促进减数分裂基因表达，防止精子生成基因过早表达。

图6 Setdb1与γH2AX和TRIM28存在相互作用

7，  在MSCI中TRIM28是一个介导DDR-SETDB1连接的桥梁因子

如图6A，在粗线期敲细胞中敲除H2afx后SETDB1不能定位在XY二价体上，这一结果同样支持SETDB1位于DDR网络的下游。然而，性染色体Setdb1招募的机制并不清楚，但TRIM28、hnRNP K和KARB-ZFPs在其他情况下能招募Setdb1^9-11。为确定参与SETDB1招募的蛋白因子，研究工作者以P15的野生型雄鼠的睾丸为材料，使用γH2AX和SETDB1抗体做诱饵富集了与两者发生相互作用的蛋白并进质谱，两者显著富集的蛋白包括TRIM28和hnRNP K，但并没有KARB-ZFPs（图6B和6C）。接着，研究工作者通过免疫荧光在早期粗线期细胞中分析TRIM28和hnRNP K的定位：hnRNP K定位在常染色体，在性染色体上并没有定位（详见补充材料S7D）；相反，TRIM28定位在性染色体上（图6D）。此外，免疫共沉淀显示TRIIM28分别与γH2AX和SETDB1存在相互作用（图6E）.因此，TRIM28是连接DDR与SETDB1的桥梁因子。

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小结

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如图7，本文研究提示SETDB1通过TRIM28与DRR网络相互交流：未联会感受因子和DNA损伤响应因子被招募至XY配对，引起γH2AX积累； γH2AX招募TRIM28和SETDB1，介导H3K9me3形成；HP1-TRIM28复合体与H3K9me3结合，招募更多的SETDB1，促进抑制染色体状态的形成；在H3K9me3下游的USP7和RNF8介导的多聚泛素化通路进一步促进性染色体重塑。

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