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不知道你有没有发现，越来越多的文章开始既做了内容丰富严谨的数据分析（Dry Lab），又结合了深入细致的实验验证（Wet Lab）,这种干湿结合似乎是目前的流行趋势。所以这一篇文章，小编邀请了实验室~~~湿实验大将一枚，来给大家讲解下，如果你数据分析预测了一个蛋白质与DNA的相互作用，如何用实验来证明~~ 凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）被广泛用于探究蛋白质与DNA或RNA序列之间的直接结合作用。基本原理是标记的核酸序列与蛋白质结合形成复合物后，其在凝胶电泳中的迁移速度变慢，从而判定特定核酸序列和蛋白质之间的相互作用。本文主要就凝胶迁移技术的基本实验步骤及注意事项进行一个简单介绍。 凝胶迁移实验主要包括探针和蛋白的制备、蛋白与探针结合反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 转膜、交联、检测这六大步骤。 1. 探针和蛋白的制备 根据实验要求可以设计长度20-60bp的特异性探针用于实验组及非特异性探针用于对照组。然后将序列交于生物公司进行序列合成及生物素标记，或购买相应的试剂盒, 自己对探针进行标记。出于安全考虑，敏感性较高的同位素标记技术已经较少使用。用于结合反应的蛋白可以来自样本的总蛋白、核蛋白或原核表达纯化的单一目的蛋白。 2. 蛋白与探针结合反应 一般我们可以设计如下五组反应： （此图来自碧云天EMSA试剂盒说明书） 此图的两个冷竞争反应是为了证明探针结合的特异性，而Super-shift反应中通过特异性抗体的结合形成更大复合物来证明目的蛋白的存在。其预期结果如下图：↓ （此图来自thermofisher scientific EMSA实验技术指南） 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在实验过程中，我们是检测活性蛋白与核酸序列的相互作用，所以我们会制备非变性的聚丙烯酰胺凝胶，浓度大概6%。在0.5x TBE 中，恒压100V进行电泳，跑40分钟左右即可。但得根据自己的探针大小、蛋白特性、胶的浓度等实际情况来调整电泳时间。 4. 转膜 按照以下顺序装配转膜装置：负极→海绵→滤纸→凝胶→尼龙膜→滤纸→海绵→正极，将转膜装置放入电转槽中，加入0.5X TBE，将电转槽置4℃环境，200mA恒流转膜90分钟。同时要注意避免海绵、滤纸、膜之间气泡的产生。 5. 交联 将转膜完毕的尼龙膜取出，在波长为312nm的紫外灯下，距离为0.5cm,照射10-15分钟，或用专门的紫外交联仪选择254nm紫外波长， 120mJ/cm2，交联45-60秒。 6. 检测 通过封闭、洗涤、孵育等步骤将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与探针进行连接反应，在这些过程中要防止膜的干燥。然后加入酶底物进行反应，最后用X光片进行压片，观察显影定影结果。 怎么样，你学会了吗？ 如有问题，欢迎留言咨询哦(#^.^#) 作者：冬天 |
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