寻找分子上游机制的模式和方法（一）

Jennymgozseons 2018-01-28

展开全文

如果一个分子在疾病组（实验组）是显著高表达的，而我们需要寻找其上调表达的原因，如昨天文章所说，可以有很多层面的角度来考虑，今天我们选的角度是转录因子。

关于转录因子，我们在第一季就介绍过，简单来说就是这类蛋白通过结合到基因的DNA序列上，调控RNA的转录活性，从而使RNA产生增加或减少，最终蛋白水平也发生变化，而根据我们对转录因子这类蛋白的研究总结，很多转录因子都对特定的识别一些相对保守的序列。因此，我们可以根据他识别序列的保守性来进行预测靶基因。其实转录因子这类蛋白我们常常见到，比如大名鼎鼎的抑癌基因P53，缺氧诱导因子HIF1a，参与干细胞分化的nanog，EMT相关的twist、snail、slug等等，正是因为其能调控一系列分子的表达，所以其功能一般都比较重要，很多常见的信号通路命名时也是挑这种关键分子来命名的。

不过，在实际的研究中，我们通常是从一个不太知名的分子做研究的，这里的分子包括编码基因、lncRNA、microRNA等等，因为都存在转录这个过程，所以转录因子作为分子异常表达的一个环节，必然会被考虑到。我们常说研究的时候需要联系明星分子，而明星分子的类型有太多种，今天我们就来说如何联系一个“不知名分子”和明星转录因子。

前面我们说很多转录因子结合的DNA序列都有一定保守性并可以用来进行预测，那么我们举个例子具体来看，我们随便选一个分子HSPA12A，这里我们先介绍一个网站：

Qiagen公司的：http://www./chipqpcrsearch.php?app=TFBS

当然，我们也可以从以前介绍过的genecards数据库进入：

我们接着从qiagen公司输入HSPA12A然后点击search：

在出来的结果中，我们可以看到红色箭头是转录起始位点（TSS），绿色的为转录因子结合位点，点击左下角可以看到更多分子：

这里我们选第一个sox9，单击后显示：

单击绿线可以看结合的具体序列，蓝色箭头是在做chip-qpcr的时候设计引物的位置。

当然，如果这里没有找到，我们也可以通过PROMO把DNA序列（一般是启动子）放进来直接预测：

http://alggen.lsi./cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3

好了，通过这个网站我们已经把HSPA12A和sox9给联系起来了，当然，如果要展开研究两者的关系，最好两者之间存在表达相关性、功能上一致，所以大家需要补一下表达和功能实验，下面我们说的是为了证明sox9这个蛋白结合到HSPA12A的DNA序列上常常要做的三个实验：染色质免疫共沉淀（CHIP）、凝胶迁移实验（EMSA）和荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay）。

CHIP,chromatin immunoprecipitation, 染色质免疫共沉淀

原理其实很简单，通过蛋白的抗体去拉蛋白，然后将拉下来的DNA进行检测，检测方法大家有的听过：CHIP-seq（测序），CHIP-on chip（芯片）和ChIP-qPCR。CHIP不仅用于转录因子的检测，还常用于组蛋白修饰。虽然原理很简单，但是具体操作起来就比较复杂了，特别是CHIP级别抗体的选择。

当然，这里有一个问题：如果蛋白A与DNA直接结合，我们可以通过CHIP来检测；那么当A通过B与DNA结合，也就是说，B与DNA直接结合，而A通过与B直接作用从而导致与DNA结合的时候是否可以通过CHIP来检测？答案是肯定的。所以，如果出现A-B-DNA这种情况是，我们还需要进一步做B-DNA的CHIP和A-B的IP实验。这个问题是有小伙伴在后台留言的，我们一并回复掉。

EMSA，凝胶迁移实验，Electrophoretic mobility shift assay

EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。