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好久不见，大家好！今天跟大家掰扯掰扯EMSA 当最初看文献遇到这个实验时，迎面而来的各种探针和十几条泳道让我有些懵逼，吭哧吭哧大体明白了实验，但是对一些细节还是不太清楚 近日看了一个视频彻底明白了这个实验原理，趁着还是热乎的，分享给大家。此外很遗憾因为咱不做实验，所以这篇推送不涉及高端实验技巧骚操作
EMSA初体验凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)）是常用的功能分析实验，主要用于研究结合蛋白与DNA/RNA结合序列相互作用，可用于定量和定性分析。
先来看一看我主要的几个大兄弟 细胞粗提取液或者纯化蛋白 标记（labeled）探针，待研究序列 
看到没 末端标记 竞争性探针，用于竞争性实验检验蛋白是不是与标记探针特异性结合，需要过量加入，使劲怼就是了 
你问为啥它们cold呢......因为没有标记（unlabeled）罩着可不就冷吗？ 
原理简单说就是一句话，与蛋白质结合的核酸探针在凝胶中移动速度更慢（迁移率低），未结合的探针移动的快。 
如图，同位素标记（label）的探针与纯蛋白或细胞提取液孵育后，在凝胶中加样电泳（加样孔在上方），与蛋白质结合的探针移动的慢（上方条带），未结合的探针移动的快（下方条带）。 随着加入的蛋白质不断增加，结合有蛋白的探针越来越多，自由的探针越来越少（上方条带也来越来越深，下方条带越来越浅）。
super shift
当想知道细胞提取液中与DNA结合的蛋白时，会先用一些生信工具预测可能与该区域结合的蛋白质，然后合成该蛋白质的抗体，再将抗体加入EMSA实验中产生一条新的super shift条带，因为若该抗体与相应蛋白质结合以后分子量更大，移动更为滞后。
如图，加入另一种蛋白后，之前的条带变浅，产生一条新的滞后条带 这里需要注意的是，这种滞后的原因可能是新蛋白与原先的蛋白结合，也可能是结合到探针的另一个位置上，所以严谨的话需要加一步，单独加入探针和新蛋白，看看它们是不是也会结合。 PS. 如果想能够看出条带，是需要加同位素标记的，上图没有显示应该是疏忽。
整体来康康～
 在放射自显影后，左图中O住的东西会显现，而被×掉的部分则不会显现
泳道1：input DNA（也就是标记探针），全都移动到最下面，显示出较粗的条带 泳道2：加入标记探针和蛋白质，一部分标记探针与蛋白质结合迁移滞后，产生了两个条带 泳道3：加入过量的特异性竞争探针挤占了蛋白质上的结合位点，虽然也迁移滞后，但是因为没有标记，所以不会显现 泳道4：非特异性探针即使过量，也不能争夺标记探针与蛋白质结合，因而显现标记探针与蛋白质结合的条带，证明了标记探针与蛋白质结合的特异性 泳道5：加入蛋白质的抗体，产生super shift，确定与标记探针特异性结合的蛋白质身份
再给个栗子
比如：研究某区域SNP[A/G]对于该区域与转录因子结合强弱的影响。 会先合成该SNP所在区域几十bp的标记探针(2种)和非标记探针（2种）(用于竞争性实验) -----A------* -----G------* -----A------ -----G------ 然后提取某种细胞的粗提取液，设计上述类似实验，研究哪个allele结合转录因子的能力更强，是否是特异性结合。 eg.
Abolishment of an Oct-1 binding site in the CHRNA3 promoterby the rs6495309T>C change. A,electrophoretic mobility-shift assay with biotin-labeled rs6495309T or rs6495309C probes and H1299 nuclear extract.Lanes 1 and 6, probe only; lanes 2 and 7, probe and nuclear extracts;lanes 3 to 5 and 8 to 10, probe and nuclear extracts plus 100× unlabeled rs6495309T (lanes 3 and 8), rs6495309C (lanes 4 and 9), or Oct-1 consensusprobes (lanes 5 and 10).B, electrophoretic mobility-shift assay with antibody. Lanes 4 and 9,with antibody to Oct-1;lanes 5 and 10, with rabbit IgG
碎碎念时间 很多实验原理并不难，但是一些概念解释不清，或者说不够生动，很影响理解，比如EMSA中的cold probe，冷竞争实验等。EMSA很常用，也有一些该实验中文介绍，可能该说的也说的，但是我不做实验，就不容易串起来，对小白不太友好。 另一方面，如果我们在接触新事物时先搞清楚概念和背景，串起来理解，它就不那么玄乎了和高大上了，对后面的学习也更有帮助，反之，亦然。
参考资料 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) Fig 5.36 https://www./watch?v=G7VZfFM5YM8 Wu C, Hu Z, Yu D, et al. Genetic variants on chromosome 15q25 associated with lung cancer risk in Chinese populations. Cancer Res. 2009;69(12):5065–5072. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-0081
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