|
对于新手小白做这些大实验时可能不知所措，为了方便学习，将相关实验进行归纳总结:
原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
首先实验准备工作：
需要两个试剂盒 碧云天（GS008 GS009）:一个用于生物素标记 ，一个用于凝胶迁移实验
配备TBE缓冲液可以配置成 5× 或者 10×的储液。
10x TBE 储液配制方法：
将Tris（FW=121）108g，硼酸（FW=61.8）55g，40 ml 0.5 M EDTA 溶解在600 ml的去离子水中；而后调节pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时稀释10倍 即为1×TBE Buffer。
目的蛋白原核诱导纯化
构建载体
（1）设计重组引物TF-F，R，进行PCR扩增，PCR产物纯化回收。
（2）使用NEB限制性内切酶将pet28a载体线性化，并进行纯化回收。
（3）利用重组试剂盒进行重组反应(Vazyme, C112-02）。
（4）将反应体系加入DH5α感受态中，进行转化，涂板，挑斑检测。挑选阳性菌液过夜培养，提质粒，-20℃保存备用。
蛋白的表达和纯化
参照康为世纪试剂盒：His-tag 标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）
探针标记
1.将合成的单链探针退火成双链并且加生物素标记，使用标记试剂盒（碧云天），具体步骤如下：
（1）使用1xTEN buffer溶解单链探针，将互补的单链探针按1:1混匀。
（2）95℃加热10分钟，自然降温到15-25℃。
（3）取出退火探针，加入适量的1 x TEN buffer稀释浓度至3-4pmol/ µl.。
（4）将100ng退火探针置于无酶的PCR管中，加去ddH2O补至10 µl。
（5）按以下体系将各组分混合，37℃孵育30分钟
a. 参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100µl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
b. 用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37ºC孵育30分钟。
c. 加入2.5µl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
2. TdT的去除：
a. 探针标记反应终止后，加入52.5µl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
b. 12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
3. 探针的纯化(选做)：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
a. 对于100µl标记好的探针，加入1/4体积即25µl的5M醋酸铵，再加入2体积即200µl的无水乙醇，混匀。
b. -70ºC至-80ºC沉淀1小时，或-20ºC沉淀过夜。
c. 4ºC，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
d. 4ºC，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 e. 加入50µl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20ºC保存。
4. 生物素标记探针标记效率的检测：
a. 取5µl Biotin-Control Oligo (0.4µM)，加入196µl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
b. 取3µl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27µl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
c. 参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2µl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100µl。
d. 滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
e. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30-45秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
f. 随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。
g. 如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计算出探针的标记效率。例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同，则说明探针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1µM，而实际被生物素标记的探针约为0.5µM。探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。有文献报道标记效率和3'末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有关。由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3'端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现标记效率大于100%的情况。
5. 生物素标记EMSA探针的制备：
a. 对于步骤2B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步。
b. 加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。
c. 如下设置PCR仪进行退火反应：
注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1ºC的功能，也可以设置为每90秒下降1ºC。
d. 退火反应结束后，-20ºC保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。
凝胶迁移实验
EMSA胶的配制：
a. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
b. 按照如下配方配制20ml 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
注意：此实验中需去除SDS变性剂
c. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理
EMSA结合反应：
a.
b. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25ºC)放置20分钟。
c. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
电泳：
a. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
b. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
c. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30ºC，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
转膜：
a. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。
c. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。 碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化学发光法EMSA试剂盒 3 / 5
f. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4ºC冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
交联：
a. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒(根据经验，建议交联30min)。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。
c. 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
化学发光法检测生物素标记的探针：
a. 37-50ºC水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50ºC之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
d. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
k. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。
m. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
n. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
|
