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RNA测序的前世今生生 N 2005年，人类基因组计划完成，我们以为揭开了人体2.5万个基因、30亿个碱基对的秘密，就能寻找到生命根源的奥义。然而这只是给我们打开了另一扇窗户，开启了后基因组研究的大门。为了了解基因产物的功能作用，我们需要用到转录组测序技术，对基因表达数据进行分析和处理。 转录组通常是指一个细胞中的所有转录本。特定发育阶段或生理条件下，细胞内的转录本可能与状态有很大的联系，所以我们可以通过转录本测序，对细胞的转录本进行分析研究。例如，分析细胞编码和非编码的转录本，分析可变剪切，定位基因互作网络等。然而，目前应用最多的还是通过转录组研究来确定不同条件下转录本表达模式的改变，寻找和验证新的生物学指标。 芯片技术原理与特点 在以前，芯片技术是基因组表达分析的中坚力量，在这个技术最辉煌的时期，一提到研究基因表达，人们就会想到使用芯片。Microarray芯片上排列着大量的核酸探针，可以包含生物的整个基因组或部分基因组，比如外显子、miRNA、单核苷酸多态性SNP等。在体内的基因组合成为成熟的mRNA后，我们将其提取出来，并反转录为cDNA，然后进行荧光标记。带有荧光标记的与cDNA芯片上的探针杂交，芯片上各点的信号强弱，代表了该探针目的基因的表达量。 芯片技术快捷、方便、简单，能准确的找到研究者需要找到的基因组信息——然而这也是芯片技术最大的局限：过于依赖已知的基因组信息。在探索性研究和非模式生物的研究中，芯片就找不到一些新的剪接点和突变。因此，随着测序技术的发展，测序成本不断下降，RNA测序将成为最终赢家。 测序技术的优势 高通量二代测序技术的流行将RNA测序技术和转录本分析带入了一个新的纪元。RNA测序技术的差别之处就在于把成熟mRNA剪切后逆转录为cDNA文库，然后进行测序。这样RNA测序技术就能做到芯片技术做不到的事情——发现未知的转录本、发现基因融合和遗传多态性。在测序深度足够的情况下，RNA测序技术在高丰度和低丰度的转录本检测中都比芯片有效。 在转录组测序技术中，如何有效的将成熟的mRNA提取出来，是研究者们需要考虑的问题。而关键就是去除总RNA中的rRNA，如果残余过多，大量短RNA会减少测序结果匹配到转录本的数目。根据mRNA的特点，用多聚胸腺嘧啶寡核苷酸匹配mRNA的polyA尾，就可以将mRNA提取出来，这种方法称为mRNA-seq。或者是通过杂交捕获rRNA再用磁珠吸附去除的方法，这种称为Ribo-Zero-seq；另外还有一种利用双链特异性核酸酶处理的方法提取mRNA，称为DSN-seq。 方法比较 2014年，Wei Zhao等人在BMC Genomics上发表文章。他们使用的是来自北卡罗来纳大学（UNC）和肿瘤基因组图谱计划（TCGA）的冰冻组织（FF）样本和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，然后针对rRNA去除效率、基因组序列匹配情况、转录组覆盖度、转录本定量精确性和可重复性、基因表达模式和差异基因表达以及不同测序深度下注释基因的覆盖度等六个方面进行讨论，对mRNA-seq，Ribo-Zero-seq以及DSN-seq进行了比较。 首先，研究者比较去除rRNA的相对水平，发现Ribo和mRNA-seq两种方法的去除效率比较高，而DSN-seq的去除效率就比较低了。同样，他们发现Ribo和mRNA-seq两种方法（94.0%，93.8%）的基因组序列匹配情况要优于DSN-seq（85.5%）。中位变异系数（CV）考察的是转录本平均覆盖度的离散程度，而Ribo和mRNA-seq两种方法的离散程度比DSN-seq的更低，说明前者转录本的测序结果覆盖度更一致。比较5’端和3’端转录本的差异，研究者发现Ribo-Zero比mRNA-seq测到的差异更小，原因是Ribo-Zero不需要匹配3’端的腺苷序列。 然后，研究者探究转录组的覆盖度，因为这一指标直接影响转录本丰度测量的准确度和转录本检测的灵敏度，非常重要。在mRNA-seq中超过62.3%的RNA覆盖到基因编码区，而Ribo-Zero的仅有31.5%。然而，Ribo-Zero和DSN-seq有更多的RNA覆盖到内含子和基因间区；关注10号染色体上GATA3基因的详细情况，发现Ribo-Zero和DSN-seq捕捉到了外显子和内含子跨区域部分，说明捕捉到了前体mRNA的信息。 系统聚类分析可以从整体上评估不同的检测方法能否发现生物学表达的一致性和差异性。研究者检测使用不同处理方法的相同样本是否聚类在一起，他们用之前研究的大样本RNA测序数据做聚类分析，发现在不同的RNA处理方法中，大部分样本都按照相同样本聚类到一起了。差异表达分析发现410个基因的表达量差异，而且Ribo-Zero-seq在有更多的核仁小RNA和组蛋白RNA。 和芯片杂交相比，每个样本的测序花费仍然高昂，虽然多路技术可以有效降低成本，但这种技术也会降低检测低表达基因的能力。因此，研究者比较了不同方法检测到相同的转录本所需的最低测序深度。通过比较得出，只有DSN-seq的FFPE样本需要明显更大的测序深度。 mRNA-seq、Ribo-Zero-seq、DSN-seq还有microarray的方法各有所长，各有侧重，比如mRNA-seq更侧重于外显子区域，而Ribo-Zero-seq更侧重于内含子区域等。我们需要针对不同的研究目的，采用不同的处理方法，才能保证实验的准确无误。 |
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