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荧光素酶（luciferase）是自然界中能发出荧光的酶的统称。他们可以通过酶促反应催化底物产生自发荧光。因其便与检测，灵敏度高等特性，荧光素酶常作为报告基因被广泛应用于生化检测实验中。 在生化实验中，应用最广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。两者分别催化各自的底物luciferin和coelenterazine发出不同颜色的荧光。两种荧光的吸收波长不同（luciferin波长550-570nm，coelenterazine波长480nm），故而在同一个化学反应中，两种荧光的检测互不影响，由此双荧光素酶报告基因（Dual-luciferase）系统受到广泛欢迎。 双荧光素酶报告基因系统的应用 miRNA与RNA靶向关系验证 在miRNA的研究中经常会涉及到miRNA与RNA靶向关系的验证，这其中包括mRNA中CDs区后面的3’-UTR区，long non-coding RNA（LncRNA）或者circular RNA （circRNA）等。miRNA通常是通过其种子区（seed region），及5’端2-8个碱基与目的RNA靶位点完全匹配结合（注：RNA之间存在U-G结合的模式），并在沉默复合体(miRNA-induced silencing complex)的共同作用下导致目的RNA降解，进而致使目的RNA的表达量下调。基于这个原理，miRNA-target 双荧光素酶报告基因系统被科研工作者普遍认可，用于验证miRNA与靶基因的直接靶向关系。吉玛基因采用pmiRGlo及psiCHECK双荧光素酶报告基因系统，帮助广大科研工作者解决miRNA-target验证的难题。该验证实验的基本步骤如下： 1. miRNA-target靶位点预测 通过miRNA-target数据库，如Targetscan，miRDB，microRNA.org(Miranda program) 等来预测miRNA与mRNA的3’-UTR区的结合位点。对LncRNA，circRNA以及以上数据库中无法预测到的mRNA，可以尝试条件开放型的比对方式，例如应用RNA22 V2或者RNAhybrid等网站进行预测，找出潜在的靶位点，用于后续验证。 2. 构建双荧光素酶报告基因载体 吉玛基因可以提供整套的miRNA-target RNA靶向关系验证双荧光素酶报告基因载体。 首先，将包含预测靶位点的RNA序列WT（50~200bp）用全基因合成的方式构建入pmiRGlo载体（下图左），如果靶位点正确，则luciferase-target mRNA会被miRNA靶向并降解，导致荧光素酶活性下降；相对应的，预测到的靶位点会被随机打乱造成突变MUT，为保证突变不会产生新的靶位点，MUT序列会在RNAhybrid等网站再次验证。之后MUT序列以同样方式合成构建入pmiRGlo载体。MUT载体的预期效果与pmiRGlo空载体相似（下图右），因为载体转录产生的mRNA不存在miRNA的靶位点，荧光素酶预期是没有改变的。 3. 实验步骤方法详见吉玛基因双荧光素酶报告基因实验指南 预期结果示意图如下总结：pmiRGlo双荧光素酶报告基因系统，不但可以定性验证miRNA与目的RNA的相互作用关系，更可以集体分析相互作用的位点，且经过验证的相互作用为直接靶向作用。吉玛基因帮你做实验，20-25工作日完成。敬请来电来信咨询。 吉玛基因诚邀生物领域科学家在我们的平台上，发表和介绍原创的科研成果。 |
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