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/ 前言 / 报告基因是现代分子生物学研究领域中用于潜在的顺式元件和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具，被广泛应用于基因表达调控、信号转导、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域。 荧光素酶是科研中运用最广泛的报告基因之一，其具有检测灵敏度高、结果重复性好、信噪比较高和易于检测等特点。 / 实验原理 / 荧光素酶是生物体内催化荧光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶多来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。荧光素酶的种类很多，其中应用较为广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）。 / 双荧光素酶基因报告系统（Dual-Luciferase reporter assay）/ 双荧光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，以萤火虫萤光素酶为核心reporter，海肾荧光素酶作为内参（注1），构建研究对象到相应位置，转染细胞，裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能。双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞生长状况、细胞数目以及转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。 注1：内参根据双荧光载体的不同而有所不同，并非固定不变。  图1. 荧光素酶发光原理。（A）萤火虫荧光素酶催化反应原理；（B）海肾荧光素酶催化反应原理。 / 载体选择 / 双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略。第一种是两种荧光素分别位于两个载体上，即将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上，两种荧光素酶分别用不同的启动子启动其表达。 (1) 双载体系列（两种荧光素酶分别位于两个载体上）： 目前，常用的F-Luc载体大多以pMIR-REPORT载体、pGL3系列载体为主；R-Luc载体大多以pRL系列载体为主。 1) pMIR-REPORT载体 2) pGL3系列载体 PGL3系列载体包括Promoter、Enhancer、Basic以及Control，都含有萤火虫荧光素酶报告基因，其中Control为对照载体；Basic仅含有一个Luc基因，无启动子与增强子；Promoter含有SV40启动子，可用于检测增强子；Enhancer则与之相反，即含有增强子，可用于检测启动子。 3) pRL系列载体 pRL系列载体为海肾荧光素酶报告载体，由Promega公司开发，其载体间最主要的区别是携带的启动子不同，包括CMV、SV40、TK等，即pRL-CMV、pRL-SV40、载体，将F-Luc载体与其共转染293细胞时，pRL系列载体起发挥内参作用。 (2) 单载体系列（两种荧光素酶位于同一个载体上）： 1) pmirGLO载体 pmirGLO是由普洛麦格（Promega）开发的，目前常用的一种商品化双荧光素酶报告载体。pmirGLO是设计用于定量分析miRNA活动的双荧光素酶报告载体，将萤火虫荧光素酶基因（luc2）和海肾荧光素酶基因（hRluc-neo）构建在一个载体上。萤火虫荧光素酶基因的3’端有一个多重克隆区域（MCS区域），这个区域中含有多个酶切位点，通过酶切连接过程可以插入miRNA靶点序列或者感兴趣基因的3’非编码区，用于研究转录稳定性和活性。  图2. pmirGLO载体图谱 2) psiCHECK系列载体 psiCHECK™-2载体旨在为RNA干扰(RNAi)的优化提供定量和快速的方法。该载体能够监测融合到报告基因的靶基因表达的变化。在这两种载体中，Renilla荧光素酶作为一级报告基因，目标基因可以克隆到位于Renilla荧光素酶翻译终止密码子下游的多个克隆区。对感兴趣基因的RNAi过程的启动导致融合mRNA的裂解和随后的降解。海肾荧光素酶活性降低的测量是RNAi效应的方便指标。 
图3. psiCHECK2载体图谱 / 应用范围 / 1）验证mRNA/lncRNA/circRNA与miRNA靶向互作; 2）验证转录因子与启动子互相作用； 3）验证转录因子结合位点； 4）启动子结构分析或启动子SNP分析； 5）诱导因素对启动子活性调节研究； 6）研究分析信号通路是否激活。 / 优点 / 1) 易表达：无需表达后修饰，直接具有可被检测的酶活； 2) 高灵敏度：在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光； 3) 低背景：哺乳动物无内源性荧光素酶表达； 4) 高效，通量大：检测快速，每个样品只需几秒钟； 5) 与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强。 / 实验流程 / 1) miRNA oligo合成； 2) 重组质粒制备：将相应的基因片段构建入载体构建重组质粒； 3) 细胞转染：用于miRNA靶标检测的重组质粒和miRNA共转染，通常在24~48 h后进行检测； 4) 细胞处理：细胞裂解和加入荧光素酶检测试剂等操作依照双荧光素酶检测试剂盒操作； 5) 荧光检测：使用酶标仪或具有类似功能的设备进行荧光强度检测； 6) 数据分析。 / 舒桐双荧光素酶报告基因检测服务优势 / 1）载体库全，可根据客户不同实验需求构建报告检测重组载体； 2）服务周期短，从载体构建、细胞转染、双荧光检测，整个流程20天内完成（可提供加急服务）； 3）至少3个生物学重复，检测更可靠； 4）提供原始数据和可视化结题报告。 关于舒桐 如需获得更多信息，请咨询我们： 电话： 400-6309596 15022705442（同微信） 企业官网： http://www. 产品订购/技术支持： service@ 参考文献： 1. Sherf, B.A. et al. (1996) Dual-Luciferase® reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays. Promega Notes 57, 2–9. 2. Wood, K.V. et al. (1984) Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lanterns. Biochem. Biophys. Res. Comm. 124, 592–6. 3. Lorenz, W.W. et al. (1991) Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438–42. |
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