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如果想知道细胞中转录因子或染色质重塑蛋白的结合序列信息，首先会想到染色质免疫共沉淀（ChIP-Seq）技术【1】，然而ChIp-Seq技术对于细胞量要求较大，这样才能得到超过噪音的有效富集信号。对于可培养的细胞来说这不是个问题，但对于比较难获得的细胞如早期胚胎细胞，ChIP-seq技术有些力不从心，当然不能否认颉伟组、高绍荣组等曾经利用ChIP-Seq技术分析了植入前胚胎的组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3的序列信息，收集细胞的难度以及该时期的重要性是该工作能发Nature的原因之一【2】。 新技术—CUT&RUN（cleavage under targets and release using nuclease，核酸酶靶向切割和释放）的出现使得蛋白-DNA互作研究所需细胞量从ChIP-Seq的10,000降到100-1,000。2019年4月4日，发表在Cell期刊的Resource文章进一步将该技术升级到单细胞水平，并应用于早期胚胎。他们称升级版的CUT&RUN 为超低量CUT&RUN（ultra-low input CUT&RUN, uliCUT&RUN）。文章的通讯作者是麻省大学医学院的Thomas G. Fazzio教授，共同通讯兼一作是其博后 Sarah J. Hainer，现任匹兹堡大学助理教授。 首先简单介绍一下CUT&RUN技术，该技术由Henikoff 实验室开发，与ChIP-seq相同点是使用抗体，具有特异性。不同点在于：ChIP-seq通常采取蛋白与DNA交联，继而利用超声打断DNA，这些步骤会产生背景噪音。CUT&RUN通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和Protein A（特异结合免疫球蛋白G）的介导，使与Protein A融合的微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease，MNase）切割并释放靶蛋白结合的序列，并进一步建库测序（Figure 1）【3，4】。 图1． CUT&RUN原理图 利用磁力珠结合细胞核，然后孵育靶蛋白（如转录因子, TF）的抗体和Protein A-MNase，抗体和Protein A-MNase能够通过核孔进入细胞核，MNase （图中蟹螯状图形）通过Protein A （六边形） 和抗体的介导切割靶蛋白附近的序列，使用MNase好处在于可以控制酶切过程，因为MNase的活化需要Ca2+，可通过加入Ca2+或者其螯合剂来启动和终止反应，进而将靶蛋白结合的序列从细胞核中释放至上清中，用以建库【3】。 本文对CUT&RUN技术的改进包括：更换缓冲液、体系溶积、孵育时间、spike-in DNA量以及建库制备和纯化过程的改进。 该课题组利用升级版的uliCUT&RUN技术首先在10-50万细胞量的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中研究CTCF和H3K4me3的序列结合信息。首先选用这两个蛋白是因为它们在ChIP相关研究中展现很强的抗原表位。将利用该技术获得的CTCF 或H3K4me3测序结果在这两种蛋白已知结合位点处（来源于已有文献ChIP-Seq数据）的read密度可视化，发现10细胞起始量的测序结果可以展现出类似50万细胞量的结合位点富集热图。CTCF的结合区更为狭窄集中，而H3K4me3则占据相对宽的区段。而对照组（无抗体组）的热图则没有这种特征 （图2）。 图2. 不同细胞量mESCs的uliCUT&RUN数据结果。CTCF（A）和H3K4me3 （B）的结合位点处read密度热图，横向数字指示不同细胞量，纵轴是文献报道的ChIP-Seq方法鉴定的结合区段（已知结合位点）。上下两排分别是抗体组和无抗体组。 该方法的结合位点检出率如何呢？以参考文献中ChIP-Seq方法鉴定的结合位点数为参照，CTCF实验组50细胞到50万细胞量可以检出57-99%的已知结合位点，10细胞量可以检测出25-40%，H3K4me3实验组检出率稍微低一些，500及以上细胞量可以检出42%-94%，10-50细胞量能够检出23-35%。尽管低细胞量的检出率不高，但该方法的重复性很好，不同细胞量的数据有较高的交集。此外，该方法的特异性也比较高：例如已知的CTCF motif 或同源的CTCFL/BORIS motif 是在不同细胞量样品中唯一找到的高显示（over-represented）motif。 作者进一步将此方法应用到其他干细胞相关转录因子：OCT4、SOX2 和NANOG以及组蛋白修饰，他们发现50细胞量就可以获得较高的检出率。那么这种方法是否适用于单细胞么？与单细胞RNA-Seq（scRNA-Seq）比较，uliCUT&RUN 应用于单细胞的难点在于一个细胞中蛋白结合DNA的拷贝数只能是2-4 (取决细胞所在的细胞周期) ，而单细胞中某些转录本mRNA的拷贝数可以达到上千级，所以在单细胞中应用该技术所获得检出率并不高，50个单细胞uliCUT&RUN库集中在一起可以检出25%的已知CTCF结合位点。在应用于单细胞的SOX2和NANOG uliCUT&RUN时， 能看到模糊但可辨的结合位点富集图。同时，作者观察到了单细胞SOX2和NANOG uliCUT&RUN数据图中，在它们共同结合的Pou5f1 超级增强子区段内有多处富集。提示尽管单细胞数据的覆盖度不高，但这些因子的高结合率位点仍能够被检出，显示其灵敏度。另外单细胞uliCUT&RUN的数据结果提示：TF结合位点处的read密度显示了具有该TF-结合位点互作的细胞比率，只有部分TF结合位点在多数细胞中显示被该TF占据。 uliCUT&RUN 技术的低细胞量要求和高灵敏度使早期胚胎细胞的蛋白-DNA互作研究变得简单易行。利用该方法，作者发现了体内环境下NANOG与其结合位点的互作依赖于SWI/SNF染色质重塑复合体家族成员esBAF的催化组分BRG1。在体外培养的mESCs 中，之前的研究发现BRG1敲减 后，NANOG对其结合位点的占据并无显著变化【5】。然而体外与体内环境毕竟不同，而BRG1和NANOG在发育过程中的表达次序提示二者可能有关联。BRG1敲降后，30-50 细胞的早期囊胚uliCUT&RUN数据显示NANOG对其结合位点的占据率明显降低，而NANOG在内细胞团中的表达量未受影响，提示NANOG在与位点结合之前，需要BRG1打开染色质复杂结构。而这一结果体外培养的mESCs中并没有看到【5】。 总之，uliCUT&RUN 技术将蛋白—DNA互作研究推进到低细胞量乃至单细胞，仍有较高的灵敏度。这对较难获得的细胞或组织（如早期胚胎）的研究是一大利好，利用该技术，研究人员在发现了多潜能性转录因子NANOG与其结合位点的互作依赖于SWI/SNF染色质重塑复合体组分BRG1。 原文链接： https:///10.1016/j.cell.2019.03.014 制版人：珂 参考文献 1. Johnson, DS; Mortazavi, A; et al. (2007). 'Genome-wide mapping of in vivo protein–DNA interactions'. Science, 316, 1497–1502. 2. Liu, X., Wang, C., Liu, W., Li, J., Li, C., Kou, X., Chen, J., Zhao, Y., Gao, H., Wang, H., et al. (2016). Distinct features of H3K4me3 and H3K27me3 chromatin domains in pre-implantation embryos. Nature. 537, 558–562. 3. Skene, P.J., and Henikoff, S. (2017). An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife 6, e21856. 4. Skene, P.J., Henikoff, J.G., and Henikoff, S. (2018). Targeted in situ genomewide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat. Protoc. 13, 1006–1019. 5. King, H.W., and Klose, R.J. (2017). The pioneer factor OCT4 requires the chromatin remodeller BRG1 to support gene regulatory element function in mouse embryonic stem cells. eLife 6, e22631. |
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