|
摘要： 人们普遍认为TRAF6在体内的重要作用是产生Lys63连接的泛素（K63-Ub）链激活“主”蛋白激酶TAK1。在这里，我们报告TRAF6 E3连接酶活性对于IL-1依赖的K63-Ub链的形成、TAK1活化、IL-8在人类细胞产生有助于但不是必不可少的。因为在E3连接酶失活的TRAF6突变体中，Pellino1和Pellino2产生K63-Ub链。 IL-1诱导的K63-Ub链形成、IRAK1，IRAK4和MyD88的泛素化在TRAF6 / Pellino1 / Pellino2三重敲除（KO）细胞被废除，但在TRAF6 KO或Pellino1 / 2双KO细胞中没有。 在TRAF6突变体中失活的E3连接酶的重新表达部分恢复了TRAF6 KO细胞中的IL-1信号传导，但在TRAF6 / Pellino1 / Pellino2三重KO细胞中不能。 Pellino1生成的K63-Ub链在体外激活TAK1复合物和TRAF6生成的K63-Ub链是类似的。在E3连接酶失活的TRAF6 [L74H]突变体中，早期阶段TLR信号传导和TLR依赖的IL-10分泌（受控于IRAKs 1和2）仅在原发性巨噬细胞中适度减少，但IL-6，IL-12和TNFα的后期产生（仅受控于假激酶IRAK2）消除。在巨噬细胞和骨髓向破骨细胞分化中 RANKL介导的信号通路在TRAF6 [L74H]和野生型细胞中是相似的。解释为什么TRAF6 [L74H]小鼠的骨骼结构和牙齿是正常的，不像TRAF6 KO小鼠。我们确定了独立于其E3连接酶活性的TRAF6两个重要角色。
TNF受体相关因子6（TRAF6）对在生物过程（1）是必不可少的，包括髓系分化初级应答基因88（MyD88）信号网络、先天性免疫系统RANK配体（RANKL）依赖性信号传导、破骨细胞形成、淋巴结器官发生，以及毛囊，汗腺和皮脂腺的发育。TRAF6 表达也是B细胞CD40信号，树突状细胞的成熟和发育和T细胞功能的调节所需要的。 在先天免疫中，几乎所有的Toll样受体（TLR）以及细胞因子白细胞介素1（IL-1）家族的受体通过招募衔接蛋白MyD88启动信号传导。然后，IL-1受体（IL-R）相关激酶4（IRAK4）与MyD88的相互作用，接着其他IRAK家族成员和IRAK4相互作用，形成寡聚复合物，称为Myddosome。然后IRAK1和IRAK2与TRAF6相互作用并诱导TRAF6二聚化，这触发了其E3连接酶活性的激活。 TRAF6在体外存在Ubc13-Uev1a（也称为UBE2N-UBE2V1）（一种E2偶联酶指导形成这种类型的泛素连接）的条件下催化Lys63连接的泛素（K63-Ub）的形成。多年前报道，虽然截断形式的TRAF6缺乏真正有趣的新功能基因（RING）结构域被可以恢复TRAF6敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）IL-1信号，其他实验室随后报道E3连接酶失活的TRAF6[C70A]突变体不能。这些报告导致广泛接受这一观念TRAF6的E3连接酶活性对于IL-1信号传导是必需的。此外，显示TRAF6产生的K63-Ub寡聚体在体外激活蛋白激酶TAK1（也称为MAP3K7）。 TAK1在MyD88信令网络中起着关键作用，因为在TAK1 KO MEFs（TRAF6敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞）中或在表达催化失活的TAK1（20）的MEF中IL-1信号被消除。细胞表达两个TAK1复合物，每个复合物都包含TAK1催化亚基和TAK1结合蛋白1（TAB1）加TAB2或相关的TAB3。 K63-Ub链与TAB3和TAB2的C末端Npl4锌指（NZF）结构域相互作用被认为诱导构象变化进而激活TAK1。 TAK1的两个主要作用是激活经典IκB激酶（IKK）复合物和促分裂原活化蛋白（MAP）激酶启动p38 MAP激酶和c-Jun的激酶（MKKs）N-末端激酶1和2（JNK1和JNK2）。IKK复合体的IKKβ激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子5（IRF5），它们对于编码促炎症的基因的转录是必需的。 （TRAF6对许多生物过程（包括操作）至关重要，包括先天免疫系统和骨形成。TRAF6（一种E3泛素连接酶）的酶活性被认为在触发这些过程中起着举足轻重的作用。在本文中，我们通过构建表达催化无活性的TRAF6突变体小鼠重新检验了这个假设。小鼠的骨骼结构是正常的，并且细胞内免疫系统主要的信号通路仍然可以开启。我们发现其他E3连接酶，Pellino1和Pellino2在表达催化失活的TRAF6人类细胞可以产生泛素链开启免疫信号 我们的研究结果确定TRAF6独立于其酶活性的重要作用。） 结果： 在TRAF6 KO IL-1R *细胞中IL-1依赖的K63-Ub链的形成未受损伤。我们最初的研究在稳定表达低水平IL-1R的HEK293细胞（IL-1R *细胞）（方法）中进行。这是一个简单的模型系统，利用CRISPR / Cas9基因编辑技术可以很容易地中断兴趣基因。与其他哺乳动物细胞类似，我们发现在IL-1R *细胞中IL-1β信号需要TRAF6的表达和TAK1以及TAK1的蛋白激酶活性（图S1A-C）。TRAF6的KO不影响检测的MyD88信号通路任何组分的表达，如后面讨论的那样，除了Pellino1外，他们的表达还增加了。 为了研究IL-1β依赖性K63-Ub链的形成，我们使用Halo-NZF2珠从细胞提取物中捕获它们。捕获是定量的，因为在第一次Halo-NZF2拉下来之后获得上清液第二次下拉时没有更多的K63-Ub链被拉下（图1A）。我们发现K63-Ub链存在于未用IL-1β刺激的细胞中，但在用IL-1β刺激10分钟后的细胞中，K63-Ub链是增加的。重要的是，IL-1β依赖性的K63-Ub链形成在TRAF6 KO和表达TRAF6的IL-1R *细胞中是相似的（图1A），这意味着在TRAF6 KO细胞中有另一种IL-1活化的E3连接酶产生K63-Ub链。 接下来，我们设计了TRAF6 KO IL-1R *细胞重新表达未标记的E3连接酶失活的TRAF6突变体或有一个强力霉素诱导启动子的WT TRAF6，两者内源TRAF6（图1C，顶部）的水平是相似的。有趣的是，重新表达的TRAF6 [L74H]或TRAF6 [C70A]部分恢复，而WT TRAF6的再表达完全恢复了IL-1β信号传导（图1C，来自Top的图2-8）和IL-8产生（图1D-G）到TRAF6 KO细胞。 在TRAF6 KO IL-1R *细胞中IL-1β信号传导也可以恢复，通过TRAF6[120-522]（其缺乏含有RING结构域的TRAF6的N-末端119个残基）或TRAF6 [160-522]（缺少RING域加上第一个锌指（图1H））的重新表达，这个实验证实了在IL-1R *细胞中IL-1β信号传导不需要TRAF6的E3连接酶活性。 Fig. 1. IL-1R *细胞中IL-1β信号传导不需要人TRAF6的E3连接酶活性。 （A）WT或TRAF6 KO IL-1R *细胞被刺激10分钟，用Halo-NZF2珠从细胞提取物中将K63-Ub链拉下（PD）。使用新鲜Halo-NZF2珠子下拉第二次上清液。用SDS释放K63-Ub链并通过用特异性抗体免疫印迹检测。（B）WT TRAF6的活性（5.0nM），使用FLAG-ubiquitin指示的TRAF6突变体（50nM）。在SDS中终止反应，形成的Ub链通过用抗FLAG（其也检测Ub负载的UBE1）免疫印迹检测。 （C）在TRAF6 KO IL-1R *细胞中在强力霉素诱导型启动子的控制下未标记的WT TRAF6，TRAF6 [C70A]或TRAF6 [L74H]被再表达。用IL-1β刺激后，将细胞提取物在SDS中变性，用识别所有形式的TRAF6，TAK1，p38αMAPK和GAPDH的抗体以及识别磷酸化（p）形式的TAK1，IKKα/β，p105，JNK1 / 2和p38α/γ的抗体进行免疫印迹。 （D）用IL-1β刺激WT和TRAF6 KO IL-1R *细胞，然后提取RNA，IL-8 mRNA通过定量RT-PCR（q-RT-PCR）测量。结果显示mRNA相对于未受刺激的细胞中的水平增加倍数并且以平均值±SEM呈现（n = 3）。（E）与C中一样，除了通过ELISA确定IL-8的分泌。结果以平均值±SEM（n = 3）表示。（F和G）和D和E一样，除了WT TRAF6，TRAF6 [C70A]或TRAF6 [L74H]在TRAF6 KO IL-1R *细胞中重新表达。 （H）与C中一样，不同之处在于TRAF6 KO IL-1R *细胞用FLAG标记的WT TRAF6，TRAF6 [120-522]或TRAF6 [160-522]被重建。 * P <0.05（方法）。
Fig. 2.在HaCaT细胞中IL-1β或Pam2CSK4信号传导不需要TRAF6的E3连接酶活性。 （A和B）IL-1β信号在TRAF6 KO（A）和TAK1 KO（B）HaCaT细胞中被消除。WT HaCaT细胞和两个独立克隆TRAF6 KO HaCaT细胞（克隆22和44）或TAK1 KO HaCaT细胞（克隆45和81）用IL-1β刺激，然后用所示抗体进行免疫印迹。 （C）WT TRAF6或E3连接酶失活TRAF6 [L74H]或TRAF6 [C70A]突变体在多西环素诱导型启动子控制下在TRAF6 KO HaCaT细胞（克隆44）中重新表达。 细胞用IL-1β刺激，用所示抗体进行免疫印迹。 （D）与C一样，不同之处在于用TLR2 / 6激动剂Pam2CSK4刺激HaCaT细胞。 与TRAF6 / Pellino1 / 2三重KO细胞（图3D）相反，在TRAF6 / Pellino1或TRAF6 /Pellino2双KO细胞（图S4A和B）中，E3连接酶失活的TRAF6突变体的再表达部分恢复IL-1β信号，表明Pelino1或Pellino2在表达TRAF6的E3连接酶失活突变体的IL-1R *细胞中互相冗余操作产生启动IL-1β信号传导所需的K63-Ub链。为了直接研究K63-Ub链的形成，我们使用Halo-NZF2珠从细胞提取物中捕获它们（图1A）。TRAF6 KO细胞，Pellino1 / 2双KO细胞和WT细胞，而不在TRAF6 / Pellino1 / 2三重KO细胞中（图3E，底部，泳道10-15）IL-1β刺激诱导的形成K63-Ub链。一些响应于IL-1而形的成K63-Ub链与Myddosome的组分共价连接。重要的是，IL-1β依赖性形成Ub-IRAK1，Ub-IRAK4或Ub-MyD88在Pellino1 / 2双KO细胞和TRAF6 KO IL-1R *细胞中仍然很强，但TRAF6 / Pellino1 / 2三重KO IL-1R *细胞（图3E）没有。类似的结果也在两个不同的独立分离的克隆中获得。这些发现证实了TRAF6和Pellino1和2功能冗余形成IL-1β依赖的K63-Ub链，K63-Ub-IRAK1，K63-Ub-IRAK4和K63-Ub-MyD88。 泛素链附着于IRAK1，IRAK4和MyD88形成“杂合”分子，包括含有Met连接的泛素的 Fig. 3.TRAF6E3连接酶活性和Pellinos 1和2功能的冗余在IL-1信号传导网络中地起作用。 （A）IL-1α刺激永生的WT和TRAF6 KO MEF，Pellino1免疫沉淀细胞提取物，并按方法（上）所述测定。通过免疫印迹检测免疫沉淀物和细胞提取物中Pellino1的水平（第二和第三小图）和细胞提取物中的GAPDH（底部）。（B）TRAF6或Pellino1生成的K63-Ub链激活TAB1-TAK1-TAB3复合物。对TAK1的活化进行偶联分析，包括它的底物MKK6和p38γMAP激酶（MKK6的底物）（方法）。（C）WT，TRAF6 KO，Pellino1 / 2（Peli1 / 2）双KO和TRAF6 / Pellino1 / 2三重KO IL-1R *细胞的两个独立克隆（B6，C5）用IL-1β刺激，，并用所示抗体对细胞提取物进行免疫印迹。 （D）在TRAF6 KO或TRAF6 / Peli1 / 2三重KO IL-1R *细胞（克隆B6）中重新表达带有标记的WT TRAF6，TRAF6 [L74H]或TRAF6 [120-522]。这些细胞（泳道3-18）和未转染的WT IL-1R *细胞（泳道1和2）用IL-1β刺激，提取物用所示抗体进行免疫印迹。 （E）与C一样，除外在固定化的Halo-NZF2珠上捕获泛素化形式的MyD88，p-IRAK4，IRAK1和K63-Ub链，并通过特定的抗体免疫印迹。（F）Halo-TUBE从捕获IL-1刺激（10分钟）WT和TRAF6 KO IL-1R *细胞的提取物中泛素化IRAK1。接着λPPase温育，用（+）或不用（-）Otulin（方法），用SDS释放IRAK1并通过免疫印迹鉴定。因为在TRAF6 KO细胞中Ub-IRAK1的形成增强，泳道1-4中的印迹暴露15s和泳道5-8中5s。 （G）用Halo-NEMO珠子从WT IL-1R *细胞或TRAF6 KO细胞（图3G，泳道1-6）的提取物或从再表达WT TRAF6或再表达表明E3连接酶失活的TRAF6突变体的TRAF6 KO细胞提取物中捕获M1-Ub链。通过用特异性抗体进行免疫印迹来鉴定M1-Ub链。与NEMO结合的IKKβ是用作加载控件。 Pam3CSK4和R848在TRAF6 KO小鼠的胎儿肝巨噬细胞中未能引发任何信号传导或细胞因子的分泌（图4A-J）。始终在在TLR刺激前孵育16小时的TRAF6 KO巨噬细胞的培养基中检测到低基础水平的IL-10。但是，和预期一样，TLR结扎没有导致IL-10的分泌量增加（图4C和G）。 类似于IL-1R *细胞（图S1D），MyD88信令网络的许多组件的表达在TRAF6 [L74H]，TRAF6 KO和WT鼠的胎儿肝巨噬细胞是相似的。然而，Pellino1的表达在TRAF6 KO巨噬细胞中适度增强（图S6）。 Fig. 4.TRAF6 [L74H]小鼠的巨噬细胞中的MyD88依赖性信号传导。 （A）用TLR1 / 2激动剂Pam3CSK4（1μg/mL）刺激WT，TRAF6 [L74H]和TRAF6 KO小鼠的胎儿肝脏巨噬细胞。SDS-变性的细胞提取物通过SDS / PAGE分离并用所示的抗体进行免疫印迹。（B）与A中一样，不同之处在于细胞用TLR7激动剂R848（1μg/ mL）刺激。 （C-F）和A一样，除了用Pam3CSK4刺激后测量培养基中IL-10（C），IL-6（D），IL-12（p40）（E）和TNFα（F）的浓度（平均值±SEM; n = 3）。 （G-J）和C-F一样，除了用R848刺激巨噬细胞。 * P <0.05（方法）。 与TRAF6 KO小鼠相反，雄性或雌性TRAF6[L74H]小鼠与它们的WT同窝仔具有相似的重量（图5A）。他们的牙齿正常发育（图5B）。它们长骨的整体组织学结构与WT小鼠相似，没有显示出骨硬化症的证据（图5C）。与这些观察一致，在RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）存在下TRAF6 [L74H]肝巨噬细胞可以分化进入破骨细胞，但TRAF6 KO小鼠肝巨噬细胞不能（图5D）。TRAF6 [L74H]和WT小鼠的巨噬细胞中RANKL依赖性信号传导在相似，尽管在TRAF6 [L74H]巨噬细胞中激活IKKα/β及其底物p105略有降低（图5E）。这不是由于这些蛋白质表达的减少（图S6）。与TRAF6 [L74H]小鼠相反，RANKL信号在TRAF6 KO小鼠中被废除。 其他实验室报告说在TRAF6 KO单核细胞再表达TRAF6 [C70A]RANKL信号不能恢复 Fig. 5.TRAF6 [L74H]小鼠中的表型和RANKL信号传导。 （A）TRAF6 [L74H]小鼠（黑色条）与其同窝小鼠（白色条）具有相似的大小。指定数量的小鼠在22日龄时称重，重量以平均值±SEM表示。一个不成对的学生t检验表明差异不显着。 （B）TRAF6 [L74H]小鼠的门齿类和WT同窝仔（33-岁的男性）爆发相似。 （C）骨（肱骨）的H＆E染色分别来自WT和TRAF6 [L74H]雄性小鼠，分别为31天和33天（比例尺，0.5mm）。注意骨骺的正常显微结构，在TRAF6 [L74H]小鼠中的生长板软骨，干骺端和骨干。用来自每种基因型另外两只小鼠的骨获得类似的结果。 （D）来自WT TRAF6和TRAF6 [L74H]小鼠但不是TRAF6 KO小鼠的胎儿肝脏巨噬细胞在100ng / mL RANKL和M-CSF刺激后6天分化成破骨细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶染色前进行细胞固定，并在明场显微镜下拍摄图像，4倍放大。（比例尺，0.2mm）（E）用RANKL（100ng/mL）刺激胎儿肝脏巨噬细胞细胞提取物蛋白质（20μg）进行SDS /PAGE和用所示抗体进行免疫印迹。 讨论： TRAF6产生的K63-Ub寡聚体引发MyD88信号和其他依赖TRAF6的过程的观念多年来巩固了先天免疫领域。然而，在本研究中，我们发现两种不同的E3连接酶失活TRAF6突变体（TRAF6[L74H]和TRAF6[C70A]）甚至完全缺乏RING结构域的TRAF6突变体，部分恢复TRAF6 KO IL-1R *细胞和HaCaT细胞中的MyD88信号传导（图1和2）。 进一步研究IL-1R *细胞显示TRAF6的E3连接酶功能不是必需的，因为在表达TRAF6的E3连接酶失活突变体的细胞中Pellino1和Pellino2能够产生激活TAK1复合物所需的K63-Ub链。 这些模型人类细胞系中的研究使我们产生敲入小鼠表达E3连接酶失活TRAF6 [L74H]突变体，在这些动物的原代巨噬细胞中研究MyD88信号传导。这些实验证实TRAF6 E3连接酶有助于但不是必须触发MyD88信号或IL-10分泌通过经由MyD88发信号的TLR配体（图4）。 尽管MyD88依赖性信号的早期阶段（0-2 h）和TRAF6 [L74H]巨噬细胞中IL-10的分泌 我们发现RANKL诱导的破骨细胞形成和RANKL信号在TRAF6 [L74H]和WT巨噬细胞中是相似的（图5）。这些发现与一份报告一致，在TRAF6 KO脾细胞中再表达缺少RING结构域的TRAF6突变体时可恢复RANKL依赖性的分化为多核破骨细胞。和TRAF6[L74H]小鼠具有正常的骨结构和牙（图5）一致。这些发现证明了TRAF6的E3连接酶活性对RANKL信令不是必需的。 进一步利用TRAF6 [L74H]鼠来研究TRAF6的其他重要作用（参见简介）是否需要其E3连接酶活性，如果不需要，Pellino亚型产生的K63-Ub链在这些系统中是否需要（图3）。这些研究还需要将TRAF6 [L74H]小鼠与Pellino1和Pellino2表达E3连接酶失活突变体的小鼠杂交，以产生所有三种E3连接酶活性缺陷三敲鼠。 这项研究的一个重要结果是它确定了两个TRAF6在MyD88信令网络中独立于其E3连接酶活性的重要作用。首先，尽管在表达E3连接酶失活的TRAF6突变体的细胞中，Pellino1和Pellino2产生MyD88信号所需的K63-Ub链，没有信号传导发生在TRAF6 KO细胞中，尽管形成未受损伤K63-Ub链。这些发现意味着TRAF6，但不是它的E3连接酶活性，将K63-Ub链形成偶联激活TAK1。其次，由线性泛素装配复合物（LUBAC）催化IL-1依赖M1-Ub链的形成在TRAF6 KO细胞中大大减少，但可以减少通过重新表达无E3连接酶活性的TRAF6突变体部分恢复。M1-Ub链不需要IL-1依赖性TAK1-催化激活MAP激酶，但需要TAK1催化激活经典IKK复合体。因为IL-1刺激不会改变LUBAC的催化活性，并且在TRAF6 KO细胞中LUBAC（HOIP，HOIL-1和Sharpin;图S1D）的组分的表达不受损伤，这些观察结果表明，TRAF6可能在招募LUBAC到Myddosome过程中起关键作用。TRAF6如何精确地实现这两个重要的“脚手架”角色是未来研究的一个有趣的问题。 参考文献： 1 Strickson S, Emmerich CH, Goh ETH et al. Roles of the TRAF6 and Pellino E3 ligases in MyD88 and RANKL signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 2017; 114:E3481-E3489. 各位读者： |
|
|
