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CRISPR基因编辑系统已被广泛用于基础科学研究、生物技术开发、农作物改进，以及基因和细胞疗法。但是许多研究表明，CRISPR基因编辑系统存在一定程度的脱靶效应。这种脱靶性对于CRISPR基因编辑系统在基因治疗领域的应用产生了潜在的危害，也会对使用CRISPR基因编辑的生物学研究结果产生干扰。 因此，提高CRISPR系统的核酸酶精确度和特异性，降低其脱靶性，具有非常重要的作用和意义。 2019年4月15日，Nature 子刊 Nature Biotechnology 杂志发表了一项最新CRISPR基因编辑研究成果，该研究通过在sgRNA的间隔区设计二级发卡结构，可以将CRISPR基因编辑的特异性提高几个数量级，表明RNA的二级结构可以调节多种不同的CRISPR系统的活性。 论文题目：Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures. 通讯作者：Charles A. Gersbach（美国杜克大学生物医学工程学院） CRISPR/Cas系统是细菌和古菌中独有的一种适应性免疫系统，通过对核酸的切割作用来抵御病毒和外源核酸的入侵。该系统于2012年被解析，并于2013年由张锋等人首次用于哺乳动物系统的基因组编辑。此后CRISPR/Cas基因编辑系统的到了迅速发展和应用。 Ⅱ型CRISPR/Cas系统只需要单一蛋白酶执行核酸的切割，相对简单易用，因此，虽然Ⅰ型CRISPR/Cas在细菌和古菌中的分布更为广泛，但CRISPR/Cas系统主要还是集中在Ⅱ型上。不过，就在几天前，Molecular Cell 杂志在线发表了一篇Ⅰ型CRISPR/Cas系统成功编辑真核系统的论文：CRISPR/Cas3：高效实现基因大片段敲除。 目前已经开发了多种可用于基因编辑的核酸酶（包括Cas9、Cas12a、Cas12b等），但是许多研究证实，这些不同的CRISPR基因编辑系统存在一定程度上的脱靶性，会导致在非目的序列造成意料之外的DNA断裂。 因此，提高CRISPR基因编辑的特异性，对于CRISPR系统的应用，尤其是在基因治疗领域的应用具有非常重要的意义。 对于提高CRISPR系统的特异性，一般有两种策略，一种是改造或增加Cas9酶，一种是改造sgRNA。显然第二种策略更有吸引力，因为这种方法不需要增加基因编辑组件的数量，也更为简便。 该研究团队通过在sgRNA的5'末端设计发卡（haripin）结构，称之为hp-sgRNA，基于碱基互补配对原则以形成RNA二级结构。RNA可折叠成许多不同的复杂结构，而RNA发夹是许多RNA分子中的基本结构单元。RNA发夹由两个组成部分组成，茎和环。 接下来研究人员检验hp-sgRNA是否能提高spCas9的基因编辑特异性。spCas9来源于酿脓链球菌，是目前应用最广泛、效果最好的基因编辑核酸酶。 实验结果表明，与普通的sgRNA及截短的sgRNA相比，hp-sgRNA增加了spCas9的基因编辑活性，同时大大增加了靶向特异性。 接下来，作者检验了hp-sgRNA对其他CRISPR基因编辑系统是否有同样的效果，首先作者检验了saCas9，saCas9来源于金黄色葡萄球菌，saCas9较spCas9尺寸更小，更合适和使用AAV病毒载体递送，因此在基因治疗中的应用更为广泛。实验结果表明，类似于spCas9，hp-sgRNA同样大大增加了saCas9不同变体的基因编辑特异性。 最后，作者还检验了hp-sgRNA对Cas12a的作用，同样的，hp-sgRNA有效提高了Cas12a的基因编辑特异性。 该研究设计构建了工程化的hp-sgRNA，通过检验其对spCas9、SaCas9、SaCas9-KKH、LbCas12a、AsCas12a这五种不同的Cas9和Cas12a变体的基因编辑作用，证实hp-sgRNA不仅能够调控CRISPR基因编辑活性，更能够大大提高基因编辑是特异性，降低CRISPR基因编辑的脱靶效应。 总的来说，该研究通过简单的设计，成功的将5种最常见的Cas核酸酶的基因编辑特异性平均提升55倍，表明合理设计的hp-sgRNA是提高基因编辑特异性的有效方法。接下来的研究也将确定hp-sgRNA是否能够增强新的Cas12，以及Cas13、Cas14等的特异性。 最重要的是，该研究提供了一种简单可行的方法，有效提高了基因编辑的特异性，有望解决CRISPR基因编辑技术在临床基因治疗中的因潜在脱靶性而带来的阻碍。有助于加快CRISPR基因编辑技术在基因治疗及疾病检测领域的应用发展。 |
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