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研究的初衷及背景 随着靶向治疗、免疫治疗等新兴疗法的出现，基于分子分型、免疫表型等生物标志物检测的个体化精准治疗，已成为改善肺癌患者预后的关键。然而，晚期肺癌患者常常存在无法获取肿瘤组织、肿瘤组织标本不够或肿瘤组织含量不符合检测要求等问题，阻碍了下一步的精准诊断及治疗，其中复发患者或多线治疗失败患者尤甚。如何解决上述问题，为此类患者提供无创检测方式，进而指导临床治疗成为肺癌精准诊疗研究的国际热点，这也是本研究的出发点。 中国医学科学院肿瘤医院的王洁教授团队一直致力于通过液体活检技术全面指导晚期肺癌患者的精准治疗。液体活检因为其无创性、方便性、可动态监测等特点，对于肿瘤患者的诊断和治疗具有很强的临床应用价值。当Rizvi教授首次提出TMB是非小细胞肺癌（NSCLC）潜在的免疫治疗生物标志物时（Science.2015;348:124-128.），王洁教授团队就做出了能否通过外周血ctDNA检测TMB（bTMB）指导肺癌免疫治疗的设想。在当时，TMB检测理念刚提出不久，检测金标准尚为全外显子组测序（WES）；由于WES对肿瘤组织标本要求很高、检测时间较长、费用较高，临床上难以普及，在液体活检中的应用更是遥不可及；考虑到上述因素，王洁教授团队认为通过NGS panel检测TMB/bTMB是可行的研究方向。同时，为了让更多中国肺癌患者从精准诊疗中获益，王洁教授对研究不同阶段的目标及应用方向作出以下前瞻性规划。 构建理论体系 探索NGS panel能否替代WES进行TMB/bTMB检测。 满足临床应用 在理论可行的基础上，NGS panel设计之初需要同时考虑临床应用（全面指导免疫、靶向等治疗）及性价比（降低患者的经济负担）。 技术可行性 验证设计的NGS panel技术可靠性，对bTMB与严格配对的组织WES检测结果进行比较。 临床可靠性 最终验证NGS panel检测的bTMB与免疫治疗疗效的相关性。 研究设计及结果 研究设计 理论模型 基于TCGA 9205例肿瘤标本的WES数据，设计虚拟的NGS panel，确定panel的基因数、TMB算法和基因选择的理论模型，最终设计NCC-GP150 Panel（National Cancer Center - Gene Panel 150）。 虚拟验证 通过TCGA数据虚拟验证NCC-GP150与国际上成熟的MSK-IMPACT及F1CDx等Panel进行TMB计算性能比较；并采用NCC-GP150 Panel计算34例接受PD-1治疗的晚期NSCLC患者的TMB及其与PFS的相关性。 技术验证 基于48例NSCLC配对的血液和组织标本，计算NCC-GP150计算的bTMB与WES检测TMB的相关性。 临床评估 基于50例晚期NSCLC患者接受PD-1/PD-L1单药治疗前的血液样本，评估NCC-GP150计算的bTMB与疗效的相关性。 研究结果 研究随机抽取10～700个基因形成虚拟panel（分别随机抽取50次），发现当包含的基因数≥150个时，Panel计算的TMB与WES计算的TMB有较好的相关性，且标准差显著下降；当纳入同义突变时，panel计算的TMB与WES的相关性进一步提高。同时，研究首次纳入了能提高TMB计算性能的特定基因，例如DNA损伤修复通路相关基因(DDR)；这部分基因变异可能导致更高的TMB并与免疫治疗疗效相关；这部分研究成果于2018年8月31日先发表于《癌症研究》（Cancer Research），为NGS panel的设计提供了理论依据。  基于上述结果，研究设计了包含150基因的NGS panel，将其命名为NCC-GP 150。在实体瘤中，研究通过虚拟验证比较了NCC-GP 150计算的TMB与随机抽取150个基因生成的RGP （RAN，Randomly sampled panels）计算的TMB有更好的相关性（与WES计算的TMB相比），这一结果提示按照之前的理论纳入的150个基因对于TMB计算有更好的代表性。后续，研究通过与国际上获得FDA批准TMB检测或者有相关研究的NGS panel进行比较，结果提示NCC-GP 150与MSK-IMPACT（468基因）和F1CDx（324基因）计算TMB的性能相当（分别为r2=0.96、r2=0.97、 r2=0.96）。在疗效相关性虚拟验证（Riviz et al. cohort）中，NCC-GP150计算的TMB-H 与TMB-L相比，能有效区分NSCLC患者接受PD-1治疗的疗效，中位无进展生存期（mPFS）14.5 个月对比5.2 个月（P=0.03）。在完成虚拟验证之后，研究纳入严格配对的48例晚期NSCLC的外周血及肿瘤组织标本进行技术验证（满足未经治疗，标本间隔时间不超过14天）。NCC-GP 150计算的bTMB 与WES计算的TMB有较好的相关性；当bTMB cutoff ≥6时，达到最佳约登指数（0.59，敏感性: 88%，特异性: 71%）。这一结果也与FM 2018年8月发表于《自然医学》（Nature Medicine）的结果相当(r=0.62对比r=0.64)。在最终的临床验证环节，研究共纳入50例接受PD-1/PD-L1单药治疗的晚期NSCLC患者（外周血采集时间为免疫治疗前4周内）。当采用bTMB≥6定义为bTMB-H时，患者免疫治疗的PFS及客观缓解率（ORR）相比bTMB-L患者显著改善（mPFS: NR 对比 2.9 个月, ORR: 39.3% 对比 9.1%），且治疗响应组的bTMB水平显著高于未响应组。这一差异在PD-1/PD-L1作为一线或二线治疗的患者中更为显著（ORR: 61.1% 对比6.7%）。 最终，研究因为其创新性及设计的严谨性发表于JAMA Oncol。  体会与分享 开展此研究的初衷是希望将无创性分子分型指导下的精准治疗拓展至PD-1/PD-L1抑制剂治疗，帮助更多的晚期肺癌患者从免疫治疗中获益。既往与免疫检查点抑制剂疗效相关的预测指标都需要获取肿瘤组织标本进行检测，这无疑将众多无法接受活检或者没有再次活检条件的患者拒之门外。本团队十五年如一日地耕耘于外周血无创活检指导肺癌精准治疗领域，面对上述难题，团队再次迎难而上，希望建立基于外周血免疫检查点抑制剂疗效和预后的预测体系。 研究之初，国际上尚无ctDNA检测TMB（bTMB）的类似研究可供参考，原创性研究总会面临很多质疑与挑战，而中国研究者提出原创性理念时尤甚。该研究在外审阶段，国际上首项bTMB研究结果在Nature Medicine上率先发表，一位审稿专家认为本研究样本量过小，且因测算TMB/bTMB的基因panel已被美国FDA批准应用于临床，对研究的创新性提出质疑。在王洁教授的带领下，团队成员与合作者思路迪团队多次讨论，通过深入细致的分析，引经据典对专家提出的数十项问题逐一回复，纠正了其“偏见”及错误之处，并补充了大量额外分析数据以回应质疑。 审稿过程令人痛并快乐着，让人充满期待，亦带来了意外的收获。目前bTMB研究对免疫治疗总生存（OS）期的预测效能还有待改善。在回复审稿人问题的过程中，经过深度思考和数据分析，我们发现了这一问题背后可能的生物学机制及解决方案，提出了更优化的bTMB算法模型：LAF-bTMB。LAF-bTMB能很好地预测OS、PFS及ORR，包括预测组间疗效（免疫对比化疗）及免疫组内获益人群，这一结果在POPLAR、OAK及中国NSCLC人群中得到了验证，并在2019年美国癌症研究协会（AACR）年会上以壁报形式进行展示。相信这一研究结果经前瞻性研究验证后，或可更好地帮助临床医生选择适合免疫治疗的肺癌患者。 总结 从本研究的设计、实施、结果分析、文章撰写、一波三折的审稿过程中，我们的团队学习了很多，亦感悟良多。首先，从多维度、多层面建立无创性的靶向和免疫治疗预测体系，以促进肺癌精准化进程，是我们始终不渝的追求，而一个优秀科学问题的凝练需要博览群书、厚积薄发、充分论证；其次，多学科、跨学科团队的合作、彼此间的互相学习、致敬是实现研究目标的基础与保障；最后，在科学探索的路上，咬定青山、百折不饶的精神是决定成败的关键。我们仍在路上，今后将继续脚踏实地、砥砺前行。 00 王志杰 副主任医师 肿瘤学博士 北京协和医学院硕士研究生导师 CSCO非小细胞肺癌专家委员会委员 CSCO青年专家委员会委员 中国抗癌协会肺癌专委会青委 副主任委员 北京医学奖励基金会肺癌青年专家委员会副主任委员，内科学组副组长 中国抗癌协会肿瘤药物临床研究专委会青年委员 中国抗癌协会肿瘤综合治疗专委会青年委员 中国医促会控烟和肺癌防治专委会委员 国家自然科学基金评审专家 00 段建春 副主任医师 肿瘤学博士 硕士研究生导师 CSCO非小细胞肺癌专家委员会委员 CSCO肉瘤专家委员会委员 北京医学会肿瘤学分会青年委员会委员 教育部“创新团队”骨干成员 获2015年北京市优秀人才计划“青年骨干”项目资助 作者 | 王志杰 段建春（中国医学科学院肿瘤医院） 编辑 | 郝冉（中国医学论坛报） |
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