激动人心的Cas9新用法

九色枫林 2019-04-19

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CRISPR/CAS9技术大家已经非常熟悉了吧，目前已经成为主流的基因编辑技术。如果想发高分SCI文章不用CAS9来敲除一下基因都不好意思投给杂志社了。作为轰动生物界的牛逼技术，这项由华人张峰博士发明的技术（请原谅我自动忽略了Doudna博士）最近有哪些进展呢。

要知道一个基因的功能其研究手段无外乎Loss-of-function(LOF)和gain-of-function (GOF)。用RNAI和CAS9技术都可以方便的LOF来研究基因功能，而且两种方法均能够构建完整的靶点库用于高通量基因功能筛选。然而光有LOF没有GOF的人生是不完整的。GOF需要我们将基因CDS区构建入载体，在细胞中过表达基因。但是大部分基因有许多转录本，无法像RNAI或CAS9那样针对公共区设计靶点，只能逐个构建，此外许多巨大的基因很难构建入载体中。这些因素限制了许多研究者对低表达基因的功能研究。这些同学不用再害怕咯，一项新的技术革新已经为您可能走向死胡同的课题带来新希望。

Synergistic Activation Mediator简称SAM。他是使用CAS9方法来过表达內源基因的一种新技术。你没看错哦，是用CAS9来过表达！我们来看一下他的技术原理吧。

其实一开始张峰博士就已经开发出了只结合DNA序列而不切割的突变型CAS9蛋白dCAS9，用dCAS9和转录激活因子VP64融合后就能够特异性的定位于基因启动子区域并激活其转录。

但是优秀的科学家都是“蛮作的”，为了更有效的过表达內源基因，又开始了一系列的改造，最终得到我们见到的SAM系统

我们详细的看一下该系统的组成元件：

VP64

是一种转录激活因子，可以招募类似PC4，CBP/p300和SWI/SNF复合体等转录因子

sgRNA2.0

sgRNA2.0和传统sgRNA不同，他有两个MS2蛋白结合位置（红色颈环）

MS2-p65-HSF1

是三个基因融合产生的一个蛋白，其中MS2是用来结合p65，HSF1和sgRNA的纽带，而p65和HSF1也都是类似VP64的转录激活因子，可以招募AP-1，ATF/CREB，SP1等转录因子

这些元件合体后能够发挥屌炸天的过表达效果

对ASCL1和MYOD1两个基因的内源性过表达达到了数百倍，已经和cDNA过表达的方法差不多了。

让我们脑洞大开SAM可以用来干什么吧。首先由于基因太大无法过表达而蹲在墙角哭泣的同学终于获得了利器，此外，你是不是经常对着NCBI的页面暗暗流泪，为什么我要过表达的基因有这么多转录本！现在不用害怕了，用了SAM以后管你有多少转录本，只要是一个启动子启动的统统搞定。做过表达高通量筛选的同学也可以使用统一格式的SAM靶点库来进行大批量的过表达研究，妈妈再也不用担心我做过表达了。

而且在SAM技术的基础上，其他的“蛮作的”科学家又开发出了光控的过表达系统。在dCAS9上融合蓝光激活的CIB1和CRY2基因，连接上一个转录激活因子P65，当使用蓝光（激发GFP用的）照射，基因就能够被过表达从而将过表达作为一个可控的过程，在活体水平是一个非常有意义的技术改进。