血凝实验与抗体检测简介

习艺阁 2019-04-25

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应广大养殖朋友和一些兽医朋友的要求，今将养殖场中常做的血凝试验（HA）和测血液或卵黄中禽流感和新城疫等抗体的血凝抑制试验写出来，以供朋友参考。

血凝试验

一、血凝原理：正粘病毒（流感）和副粘病毒（新城疫）EDS病毒等有血凝素，能够使家禽的血细胞凝集。冠状病毒得经胰蛋白酶处理才能较好地凝集。

二、抗体监测原理：血凝抑制（ＨＩ）试验。抗体监测。利用抗体来中和病毒使血凝能力不断下降。 '

三、凝和不凝的判断。病毒与家禽的（有核）红细胞结合后产生凝集，红细胞带上电荷相互排斥而在一定时间内（大于半小时）不沉淀。一般的细胞则在重力的作用下沉淀下去，是为不凝集。（最后都沉）

四、血凝的判断：以完全不沉为凝集。半沉半凝集不算。（即沉的是不凝，不沉的是凝）

五、血凝试验的作用：1、判断有无病毒。（4㏒2为一标准）2、疫苗的凝集价。

六、对血细胞要求：SPF鸡血最好，健康未免疫鸡次之，免疫健康鸡最差（大量用），病鸡坚决不用。大量使用的免疫健康鸡血应多洗几遍。

七、采血方法：心脏采血1、垂直采血2、水平采血（鸡采不死）

八、采血洗血步骤：

1、取无菌10ml注射器加入几粒到十几粒枸橼酸钠（防凝血），抽取5、6ml生理盐水

2、垂直或水平采血，针头能碰到跳动的心脏后再向前进几毫米，出现回血，轻抽注射器即可

3、将血放入离心管，放入离心机中，加另一全是水的起平衡作用的离心管，使离心机从0逐渐加到1500～2000转，10 ～15分钟，停机，取出离心管，用吸管吸取上清液及一层薄薄的白细胞再加生理盐水并利用吸管的水流将红细胞搅匀，再离心，多次离心，（将细胞可能因免疫所致的影响降低。最后将红细胞配成0.5 ～1%备用。

九、血凝测定步骤：

在96（8×12）孔微量板上以1~2排（8~2×8个）为单位，用8道（芬兰产1800~2400元每个）或单道微量移液器每孔加25微升生理盐水，在每组的第一孔加25微升待测液体，然后向后倍比稀释，弃去最后一滴于盛废液的容器中。再每孔中加入配好的红细胞液25微升，在振荡器上作用2分钟。放入37℃恒温箱中。大约在25~30分钟时看一下结果。（流感比新城疫时间略早5分钟）注意设对照。（注意移液的使用，一是可调的二是大拇指压的两个刻度２５混合８次　５０加液要压到底）(更换吸头)

十、结果判定：以彻底不沉为凝集，数数即可。利用此结果进行稀释标准抗原至4个病毒单位（注意体积换算）例1ml2的10方抗原就需加生理盐水256ml。以备抗体监测之用。抗体监测与血凝试验刚好是反着的。监测鸡群的抗体水平是适用和需要的。

十一、采血制血清：

1、翅静脉、皮肤上的口要与静脉上的口要一致，否则出血包。（与兔耳静脉不一样）

2、输液管7cm、接血自流，然后封口，血清自出（需要时挤一下），也可用离心机低速离心一下。

十二、抗体监测步骤：

1、在96孔板上每孔加入25微升生理盐水

2、加入4单位的标准抗原或相近品

3、在第一孔加入待测血清或卵黄液，倍比稀释弃去最后一滴

4、各加入一滴配好的红细胞液

5、振荡2分钟放入37℃恒温箱中

6、25~30分看结果，从左始，以完全沉淀为准计数，即2的几次方。另外有的专家将3和2对调，结果一样。同时要做对照。

抗体监测

十三、数据分析：2 的8次方为一个标准，小鸡可5或6，但大鸡不行，就是该做苗了。如果数相差大，如2的3次方与2的11次方同在，就有可能是野毒感染了。有的抗体为０，就是苗没有发挥作用、鸡不行或苗有问题的。

十四、抗体监测一是准确，提升自己水平，提升门市档次；二种鸡场大量应用。

十五、另外还有酶联反应、PCR技术（确诊人AI）成本太高，不适合推广。目前实用的是胶体金试纸。价廉且操作方便对人和场所要求低.

鸡群抗体检测 2

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）

一.准备

1. 抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。（没用完的,可放在冰箱4℃保存,使用前要高压灭菌消毒）

2. .1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。

3. 被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。(注：我用的是蛋黄,较血清低1个滴度。做法：蛋黄和生理盐水1：1稀释，备用)

二.过程

（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价

1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。

2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。

3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。

4、置于微量振荡器上振荡1分钟。

5、室温静置30分钟后观察结果。

6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如果到第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。

（二）4单位抗原校正：

1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。

例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。

2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。

3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。

4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。

5、于微量振荡器上振荡1分钟。

6、室温静置30分钟后观察结果。

7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。

（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：

1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。

2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。