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在实时荧光定量 PCR 实验中，探针如何高灵敏度的检测样本至关重要。尤其是遇到细胞样本量十分有限、RNA 含量过低的情况下， qPCR Assay 的灵敏度甚至会直接影响实验成败。那我们应该如何提升 qPCR Assay 的灵敏度呢？(文末有福利 在讨论解决方案之前，我们先来分析以上情景中经常遇到的两个问题。第一个问题是，当我们实验细胞样本量比较少时，我们必须需要关注 RNA 的损失。如果我们采用传统的分离纯化方法，如过柱纯化或核酸沉，这都会导致 RNA 的产量非常低。您可能会在体系中加入载体分子（如 tRNA），但这也仍让无法确保我们能回收到样本，那有什么好的解决办法吗？ 对于培养的细胞或显微切割样本而言，采用直接裂解法是一个极佳的方案。 方法是：裂解细胞 5 分钟后，样本中的 RNA 会释放至溶液中，再进行 2 分钟终止反应，然后将裂解物直接加入逆转录反应，这样就不存在有 RNA 损失，最后将获得的 cDNA 直接用于 qPCR 反应。 但有时候因为起始的样本量有限，或者目的基因表达水平极低，即便没有 RNA 损失，我们仍然无法获得足够量的 cDNA 模板来进行 qPCR 反应，那该怎么办呢？ 这时候，预扩增反应就非常有用了。具体的方法如下：逆转录反应完成后，我们利用针对检测靶点设计的特异性引物，对目的靶点进行预扩增。我们建立了一个包含多达 100 对特异性引物的预扩增引物库，同时研发了针对 10~14 个循环预扩增反应的专用预混液。 这样有限扩增循环的预扩增可以确保维持不同靶点之间的化学计量平衡，这对于需要基因定量信息的研究人员至关重要。与此同时，通过预扩增反应我们可以获得足够的多 cDNA 以便进行稀释反应，并足以完成多次 qPCR 反应。 点击观看完整视频 ▼ 希望以上内容能够帮到各位，最后安利一个双重彩蛋给大家： ◇ 彩蛋一：有奖调研，200 份精美马克杯、10 份凌美钢笔免费送 前 200 位成功完成调研问卷的客户，我们将为您送上赛默飞精美马克杯一个；还会抽取 10 名 幸运儿，送上价值三位数的凌美钢笔。赶快点击「阅读原文」或扫下方二维码拿礼品吧，够幸运，双重礼品还可叠加！ ◇ 彩蛋二：赛默飞全球首款智能定量 PCR 仪，超值促销优惠
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