基于网络药理学的浙产栀子藏红花素类成分药理作用机制研究

摘  要：目的 运用网络药理学方法研究浙江产区栀子藏红花素类成分药理作用机制，为浙产栀子药材的合理使用与深度研发提供有价值的研究策略。方法  课题组前期研究成果显示，浙江产区栀子中藏红花素类成分含量与其他产地比较有显著性差异，依据该结果，本研究联合使用Pubchem、Uniprot、STITCH、SWISS、TCMSP多个在线靶点筛选与预测数据库，运用Cytoscape软件构建化学成分-靶点-疾病（component-target-disease，C-T-D）相关作用网络模型。对浙产栀子特征性高含量化学成分群藏红花素类化合物相关靶点进行挖掘预测，借助CTD数据库对靶点进行基因本体（geneontology，GO）富集与KEGG通路分析，进一步挖掘浙产栀子多维药理作用机制。结果 浙产栀子中藏红花素类化合物藏红花素-二-β-D-龙胆二糖苷（crocin-1）、藏红花素-二-β-D-龙胆二糖-β-D-葡萄糖苷（crocin-2）通过成纤维细胞生长因子2（FGF2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、酪氨酸激酶受体（KDR）、血管内皮生长因子受体1（FLT1）等18个靶点作用于G蛋白偶联受体（GPCR）、Rap1、RAS等信号通路，从而参与细胞信号转导过程发挥多维药理作用，这些成分主要可治疗心血管疾病、肿瘤、消化系统等18种相关疾病。结论 基于系统药理学的研究方法寻找不同产区药材特征性高含量化学成分群的关键靶点、信号通路和疾病网络，为深入研究我国不同产区中药资源的药理作用及机制提供信息和数据支撑。

藏红花素是自然界唯一存在的水溶性类胡萝卜素^[1-2]，是名贵中药藏红花的主要有效成分，主要包括藏红花素-二-β-D-龙胆二糖苷（crocin-1）、藏红花素-二-β-D-龙胆二糖-β-D-葡萄糖苷（crocin-2）、藏红花素-β-D-龙胆二糖苷、藏红花素-二-β-D-葡萄糖苷（crocin-3）、藏红花素-β-D-龙胆二糖-β-D-三葡萄糖酯（crocin-4）及新西红花苷A。由于藏红花价格

黄枝子等^[5]。以干燥成熟果实入药，广泛分布于长江以南各省区，目前以江西、湖南两省为主要种植区域^[6]。键靶点和信号通路，预测相关疾病，并构建成分-靶点-

1  材料与方法

1.1  软件与数据库

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://lsp./tcmsp.php）、Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm./）、STITCH数据库（http://stitch./）、Uniprot数据库（http:// www.uniprot.org/）、Swiss数据库（http://www. swisstargetprediction.ch/index.php）、CTD数据库（http:///）、Cytoscape 3.7.0软件。

1.2  化学成分的选取

本课题组前期研究中针对江西、四川、浙江等10个不同产区栀子药材中10种化学成分的含量数据，联合使用单因素方差分析、主成分分析和聚类分析方法进行多指标综合评价，结果显示浙江产区栀子中藏红花素类成分crocin-1、crocin-2含量与其他产区比较存在显著性差异（P＜0.05），即crocin-1和crocin-2构成浙江产区栀子药材特征性高含量化学成分群。本研究依据前期实验结果，针对浙江产区栀子药材进行研究，选取其特征性高含量化学成分群crocin-1、crocin-2作为目标成分，并借助TCMSP数据库获取目标成分的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程参数。

1.3  化学成分潜在靶点预测与筛选

Pubchem数据库获取化合物crocin-1、crocin-2的SMILES格式文件，并将其上传至STITCH数据库、Swiss数据库，将靶点种类设定为Homo sapiens，获取相关靶点，然后利用UniProt数据库中UniProtKB功能，限定物种为Human，输入所得靶点名称，得到对应的基因名称，对蛋白质名称进行矫正^[9]，得到各化合物相关靶点名称（target）、基因名称（gene）、Uniprot ID、匹配概率（probability）等结果。优先选择Swiss收录且匹配程度高的基因名称作为目标成分的重要靶点。

1.4  构建成分-靶点-疾病网络模型

采用Cytoscape 3.7.0软件构建浙产栀子特征性高含量成分群crocin-1、crocin-2相关目标成分-靶点（component-target，C-T）网络；将目标成分相关靶点导入CTD数据库，对靶点相关疾病进行预测，选取基因组百分频率（genome frequency）大于1%的疾病，构建靶点-疾病（target-disease，T-D）网络。利用Merge功能合并C-T网络与T-D网络，构建目标成分-靶点-疾病（component-target-disease，C-T-D）网络模型图，图中以目标成分、靶点蛋白和疾病为3类节点（node），节点间相互关系用边（edge）表示。利用软件Network Analyzer功能进行网络分析，以度值（degree）的大小反映节点的大小，以介数值（betweenness）反映边的粗细。

1.5  基因本体（gene ontology，GO）富集与相关信号通路分析

以标准基因名的形式将活性成分的相关靶点基因列表导入CTD数据库，对靶点进行GO富集与相关信号通路分析。GO富集分析Ontology勾选“ALL”，对Biological Process、Molecular Function、Cellular Component 3个部分进行全面富集，预测靶点的功能分布，P值设定为小于0.01；信号通路分析P值设定为小于0.01。

2  结果

2.1  目标成分靶点预测

本课题组前期研究结果显示，10个不同产区栀子药材中，浙江产区的藏红花素类成分crocin-1、crocin-2含量明显高于其他产区（P＜0.05），故本研究选取crocin-1、crocin-2作为目标成分进行相关药理机制预测研究。从TCMSP获取目标成分的ADME参数见表1。目标成分在STITCH数据库和SWISS数据库共预测得到MAPT、KDR、FLT1、FLT4、ADRA1D、GCGR等18个靶点，靶点名称、基因名称、UniprotID、匹配概率等结果见表1。

2.2  成分-靶点-疾病网络构建与分析

构建C-T-D网络图，共包含38个节点（2个目标成分、18个靶点和18种疾病），不同颜色的节点分别代表目标成分、潜在靶点及相关疾病，边代表三者之间的相互作用，节点大小依据度值变化，边的粗细依据介数值变化，见图1。分析结果表明，成纤维细胞生长因子2（FGF2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、酪氨酸激酶受体（KDR）、血管内OB-口服生物利用度  Caco-2-小肠上皮细胞渗透性  BBB-血脑屏障通透性  DL-类药性皮生长因子受体1（FLT1）4个靶点的网络节点度值排位靠前，为网络中的枢纽节点，表明它们可能是目标成分药理作用机制的核心靶点；疾病节点中，心血管疾病（cardiovascular diseases）、肿瘤（neoplasms）、消化系统疾病（digestive system

2.3  生物功能与通路分析

2.3.1  GO富集分析 将目标成分预测出的18个靶点导入CTD靶点预测平台进行GO富集分析，获取的生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集结果。GO富集分析结果显示，靶点在生物过程中，蛋白结合（proteinbinding）、阴离子配位（anionbinding）和碳水化合物衍生物结合（carbohydratederivative binding）占比例较大，见图2；在细胞组分中，细胞膜（membrane）和细胞质膜（plasma membrane）较重要，见图3；在分子功能中，细胞过程（cellular process）、代谢过程（metabolic process）和生物调节（biological regulation）作用突出，见图4。

2.3.2  信号通路分析  通路注释分析结果显示，目标成分预测出的18个靶点共涉及68条相关信息通路。共得到67条代谢通路，选择并列举出频率较高的20条相关信息通路进行分析，涉及5种类别，其中与信号转导相关的通路有12条，与信号分子及其相互作用相关的通路有2条，与疾病相关的通路有3条，与细胞过程相关的通路有1条，与有机系统相关的通路有2条，分析结果见表2。

3  讨论

药材品质的物质基础是其所含活性药效成分，原植物品种的形成从生物学角度可以看做是基因型和产地环境相互作用的产物。药材疗效的优劣与其产地密切相关，唐代《新修本草》曰：“离其本土，则质同而效异”^[10]，不同的地域适合生长不同的药材，不同的药材对不同产地的生态环境也存在适应性差异。我国幅员辽阔，地跨热带、亚热带、温带、亚寒带和高原气候区，且地势复杂，不同地区日照、温度、降水量、土壤等条件相差悬殊，从而形成了复杂多样的生态系统^[11]，不同生态系统孕育出药材的性状、化学成分含量及药效等方面也存在差别。关于药材产地与其所含化学成分含量相关研究一直以来都是中药资源学领域的研究热点，而针对不同产地药材的药效学实验研究较少，究其缘由，中药化学成分体系构成复杂^[12]，不同产地药材所含化学成分的含量高低各异，而不同化学成分通过多靶点、多途径综合调控，进而产生不同药理作用，故在中药资源学领域开展不同产地药材的药理学研究非常困难，需要从不同产地、不同药理作用角度开展大量筛选实验。本课题组前期研究整合了科研文献中栀子成分含量数据，采用单因素方差分析、主成分分析和聚类分析方法对含量数据进行多指标综合评价，得到不同产区药材特征性高含量化学成分群（即对于该成分群，该产地与其他产地比较有显著性差异），本研究基于网络药理学的研究方法寻找不同产区药材特征性高含量化学成分群的关键靶点、信号通路和疾病网络，将网络药理学方法应用到中药资源学领域，为我国不同产区中药资源的药理机制研究提供有力支持。

本研究依据前期实验结果，针对浙江产区栀子药材进行研究，选取其特征性高含量化学成分群crocin-1、crocin-2作为目标成分，利用STITCH、SWISS预测得到目标成分相关靶点18个，将18个靶点导入CTD数据库^[13]，对靶点相关疾病进行预测，按相关靶点基因百分频率由高到低排序，选取基因组百分频率大于1%的18种疾病，构建C-T-D网络模型，网络节点按度值排序，结果靶点节点中FGF2、VEGFA、KDR、FLT1排位靠前；疾病节点中，心血管疾病、肿瘤、消化系统疾病以及女性泌尿生殖系统疾病排位靠前，表明浙江产区栀子药材特征性高含量成分群crocin-1、crocin-2可能通过FGF2、VEGFA、KDR、FLT1等18个潜在靶点对心血管疾病、肿瘤、消化系统疾病以及女性泌尿生殖系统疾病发挥作用。在中药资源学领域，针对浙江产区栀子药效学实验研究，应先从抗心血管疾病、

为了深入挖掘浙产栀子特征性高含量成分群的多维药理作用机制，为靶点相关信号通路及生物功能的相关实验研究提供依据，本研究进行了GO富集分析和通路富集分析，结果显示相关靶点基因数目较高的信号通路主要包括G蛋白偶联受体介导的信号通路（GPCR）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）、Ras信号通路（Rassignaling pathway）、血管内皮生长因子信号传导（signaling by VEGF）、黏着斑（focal adhesion）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的胃泌素-环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）信号通路（gastrin-CREB signallingpathway via PKC and MAPK）、唾液分泌（salivary secretion）以及血管平滑肌收缩（vascular smooth muscle contraction）等。这些信号通路中，GPCR途径异常可见心血管疾病、肿瘤疾病；血管平滑肌收缩与心血管疾病相关；Ras与Rap1氨基酸序列高度相似，常认为Ras在信号转导通路中具有与Rap1相似的功能，Ras在调控细胞增殖和生存的网络信号途径中处于中心的位置，而Rap1主要调控细胞的黏附、胞间连接形成、细胞的分泌作用与极性^[14]，Ras信号通路与Rap1信号通路都与癌症相关；黏着斑和PI3K-Akt信号通路与肿瘤转移相关；PKC和MAPK介导的胃泌素-CREB信号通路和唾液分泌与消化系统疾病相关。

研究结果从网络药理学角度揭示了浙江产区栀子药材特征性高含量成分群相关靶点、其发挥药理作用的关键生物通路以及针对的主要疾病类型，创