基于网络药理学探讨土茯苓治疗痛风的作用机制

qsa789 2020-03-12

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摘要：目的 运用网络药理学预测土茯苓抗痛风有效成分的作用靶点及通路。方法通过TCMSP数据库和Drugbank数据库获取土茯苓有效成分及作用靶点，并运用Cytoscape软件构建靶点间相互作用网络并进行交联分析，筛选出土茯苓治疗痛风的有效成分及作用靶点，采用MAS 3.0生物分子功能系统获取通路的相关信息并制成靶点通路网络模型。结果预测得到土茯苓治疗痛风的有效成分11个和有效靶点39个，并推断其作用机制可能与脂肪细胞因子信号通路、ERbB信号通路，Toll样受体信号通路等有关，且MAPK1、RELA、PTGS2等靶点基因可能起着关键性的作用。结论基于网络药理学探讨了土茯苓治疗痛风多成分-多靶点-多通路的作用特点，为进一步开展土茯苓治疗痛风作用机制研究提供了新的思路和方法。

土茯苓Smilax glabra Roxb. 是治疗痛风的传统中药，《本草纲目》记载：“惟土茯苓气平味苦而淡，为阳明本药，能健脾胃去风湿。脾胃健则营卫从，风湿去则筋骨利，故诸证多愈”。现代研究表明，土茯苓含有黄酮、鞣质、生物碱等有效成分，可促进血尿酸排出体外，也可缓解尿酸钠晶体诱导的关节炎症反应^[1]。然而，土茯苓成分复杂多样，仅研究其单体物质治疗痛风的作用只能阐释其部分药效物质基础和作用机制，很难阐释其真正的科学内涵。

痛风作为一种尿酸钠晶体沉积于机体而引起的关节炎，与嘌呤代谢紊乱及尿酸排泄减少而形成的高尿酸血症直接相关。现已证实，促进尿酸排泄是控制血清尿酸水平和痛风风险的关键途径，并进一。此外，有研究证实痛风相关的尿酸钠晶体是通过产生软骨降解酶和促炎细胞因子导致关节破坏^[4]，这表明痛风的发病机制与免疫调节、炎症反应及多个机体调控位点都有一定的相关性，并非是单路径调节作用。因此，通过多路径对痛风进行研究显得尤为重要。

网络药理学是基于多向系统药理学和生物学提出的药物研究新方法，从多个角度将药物成分靶点网络与生物靶点网络相结合，更加系统全面地研究药物的作用机制^[5-6]。因此，本研究运用网络药理学的方法对土茯苓治疗痛风的成分及靶点进行归纳整理，并通过系统生物学分析，深入揭示土茯苓成分-靶点-通路之间的协同作用，为探索土茯苓治疗痛风的机制提供新的思路。

1 方法

1.1 土茯苓成分收集与筛选

以“土茯苓”为关键词在传统中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://lsp./tcmsp.php）中查找土茯苓所含成分，通过评价成分的体内过程，用口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-like，DL）≥0.18筛选中药的活性成分^[6]。其中OB值是评价药物能否发挥药效的重要指标，DL值代表成分与已知化学药的相似性，对确定中药成分是否对机体产生活性具有重要参考价值^[7]。

1.2 相关靶点信息的收集

将收集到的土茯苓有效成分导入到Drugbank数据库（https://www./）中进行蛋白靶点的匹配，得到成分结构所对应的靶点蛋白，并通过Uniprot数据库（https://www./）查询其蛋白所对应的基因，进行归纳整理^[7]。在TTD数据库（https://db./ttd/）和OMIM数据库（http:// www.omim.org/）检索与痛风相关的靶点基因^[7]。

1.3 网络模型的构建和分析

将所得到的土茯苓有效成分和Drugbank中得到的靶点进行归纳整理，所得数据导入到Cytoscape 3.6.0软件中进行网络构建，得到土茯苓有效成分靶点网络。在TTD数据库和OMIM数据库中搜索与痛风相关的基因导入到Cytoscape 3.6.0软件并运用Bisogenet插件构建疾病蛋白相互作用网络。同时，运用Cytoscape 3.6.0中的Merge功能将2个网络进行合并得到土茯苓可能对痛风起作用的靶点。将所得到的潜在靶点导入MAS 3.0系统（http://mas. capitalbiotech.com/mas3/）进行基因本体（GO）分类富集分析和KEGG通路分析。GO分类富集分析包括分子功能分析、生物学过程分析、细胞组分分析^[8]。最后，将分析得到的靶点通路与土茯苓成分相对应，形成有效成分-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 土茯苓活性成分的筛选

在TCMSP数据库中搜索土茯苓化学成分，共得到74个化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，同时筛去无对应靶点的成分，最终共获得14个潜在的有效成分（表1）。

2.2 靶点信息的收集和筛选

2.2.1 成分对应靶点信息的收集和筛选将收集得到的土茯苓14个潜在有效成分导入到Drugbank数据库中配对得到了274个蛋白，将所对应的靶点蛋白通过Uniprot数据库查询其对应的基因。将结果导入到Cytoscape 3.6.0软件中进行网络构建，得到土茯苓主要活性成分靶点网络（图1）。图1共有227个节点、265条边，红色箭头节点表示土茯苓活性成分，椭圆形节点表示作用靶点（黄色表示只有1个成分对应此靶点，绿色表示有2个成分作用于此靶点，蓝色表示有3个成分可作用于此靶点，粉红色表示有4个成分可作用于靶点，紫色表示有5个成分可作用于此靶点），越往中心其靶点所对应成分越多。从图1中可看出经筛选后14个土茯苓活性成分均具有多靶点，即相同的靶点可对应于不同的活性成分，不同的靶点可以对应相同的活性成分，体现出土茯苓具有多成分、多靶点的作用特点。

2.2.2 疾病靶点信息的收集和筛选在TTD数据库和OMIM数据库检索与痛风相关的基因，其中在TTD数据库中检索到16个靶点，在OMIM数据库中检索到36个靶点，合并筛去重复靶点后共得到50个靶点，将这些靶点导入到Cytoscape 3.6.0软件，运用Bisogenet插件构建疾病蛋白相互作用网络。将此网络与土茯苓主要活性成分靶点网络运用Cytoscape3.6.0中的Merge功能相映射，取交集部分最终获得39个土茯苓治疗痛风的靶点。将得到的39个靶点制成靶点间相互作用网络图，结果见图2。从图2中可看出这39个靶点间有相互作用，表明可能在某种层面上这些靶点是相互联系的并通过多途径、多方面的协调起到抗痛风的作用。

2.3 生物功能通路分析

为更进一步探究其作用通路，将所得的39个靶点导入到MAS 3.0系统中进行GO分类富集分析（图3）和KEGG生物路径分析（图4），列出分析结果排名前15的路径。其中GO分类富集分析包括分子功能分析、细胞组分分析、生物学过程分析，从图3中可以看出在分子功能层面上，土茯苓对蛋白结合、转录因子活性、类固醇激素受体活性、ATP结合等影响较大；在细胞组分中，土茯苓对细胞核、细胞质、细胞膜等影响较大；在生物学过程中，土茯苓对药物反应、泡沫细胞分化的抑制、血压的调节、生物体之间的种间相互作用、脂质代谢的负反馈调节等影响较大。图4结果显示，土茯苓治疗痛风主要涉及的排名前15的通路为脂肪细胞因子信号通路、表皮生长因子受体（ERbB）信号通路、Toll样受体信号通路、B和T细胞受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。

2.4 土茯苓活性成分-靶点-通路网络模型

将富集分析得到的排名前15的通路对应土茯苓治疗痛风的靶点及成分，构建“成分-靶点-信号通路”网络模型。此网络由61个节点和121条边构成，绿色节点代表土茯苓中的活性成分，粉红色节点代表潜在靶点，黄色箭头节点代表调控通路，边代表三者之间的相互作用，图中节点越大表明其对痛风的影响越大（图5）。分析结果表明，MAPK1、核转录因子65（RELA）、前列素内环氧化物合成酶2（PTGS2）这3个靶点基因的网络节点度排位靠前，为网络中的关键节点，表明它们可能是土茯苓治疗痛风的核心作用靶点。每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了土茯苓多成分、多靶点治疗痛风的作用机制。同时多条通路之间是通过共有靶点连接而非独立分开的，表明各条通路之间可发挥协同作用起到治疗痛风的作用。

3 讨论

0%和DL≥0.18的土茯苓候选成分，经痛风疾病靶点对接得到11个活性化学成分。其中，8个化合物有相关文献报道，分别为β-谷甾醇^[9]、谷甾醇^[10]、柚皮素^[11]、豆甾烯醇^[12]、落新妇苷^[13]、花旗松素^[14]、薯蓣皂苷元^[15]、槲皮素^[16]。除此之外，存在一些尚未被报道的生物过程及有效成分，这些生物过程和有效成分的功效将成为未来研究土茯苓抗痛风的潜在方向，如4,7-二羟基-5-甲氧基-6-甲基-8-甲酰基黄烷、顺式-二氢槲皮素、(−)-花旗松素等，其药效学及作用机制有待进一步验证。

痛风的发病机制与免疫调节、炎症反应及多个机体调控位点都有一定的相关性。因此，本研究共预测得到MAPK1、RELA、PTGS2等39个土茯苓治疗痛风的关键靶点。其中，MAPK1作为炎症常用通路中的一员，其与炎症的严重程度有密切关系，为重要的炎症评价指标^[17]。RELA基因可编码产生核转录因子-κB（NF-κB）p65亚基蛋白并参与NF-κB二聚体的形成，而NF-κB几乎是所有细胞类型中都存在的多效转录因子，是一系列信号转导事件的终点，许多生物过程如炎症、免疫、分化、细胞生长、凋亡等都与其具有非常密切的关系，所以常以此靶点作为评价药物抗痛风作用的指标^[18]。而PTGS2则负责炎症性前列腺素的产生，参与炎症和有丝分裂的发生，同时PTGS2与其他预测所得出的靶点都有密切联系。因此，这些靶点都在免疫调节、炎症反应、脂质代谢、细胞凋亡等生物过程中起着至关重要的作用，同样也是治疗痛风的重要靶点。