中医药治疗肺结节用药规律及作用机制分析

肺结节（pulmonary nodule，PN）是经影像学检查肺部存在直径≤3 cm的局灶性、类圆形阴影，可多发或孤立存在，但不伴有肺不张、肺门淋巴结肿大及胸腔积液等的一种疾病[1]。随着胸部CT技术的进步与健康体检的普及，肺结节检出率逐年增高。更重要的是，肺结节已成为肺癌诊治前移的关键端口[2]，严格把控肺结节的早诊早治对于改善肺癌患者预后和降低死亡率具有重要意义。然而，现行肺结节的西医诊疗策略以“随访-监测”为主，不仅缺乏有效的干预措施，且循环往复的过度诊疗甚至会持续加重患者的心理和经济负担[1,3-6]。

近年来，大量临床研究已证实中医药在肺结节防治中疗效确切且具有独特优势[7-13]，但由于中药复方成分的复杂性和药效物质基础及分子机制的散在性，限制了从中医视角下对肺结节的临床干预策略要点和诊疗体系形成的系统性再认识。本研究拟联合数据挖掘和网络药理学综合分析中医药治疗肺结节的临床用药规律，深入探究核心药物组合治疗肺结节的潜在靶点与机制，以期为肺结节的临床诊治及管理提供科学依据。

1 中药复方的收集与筛选

初步检索文献共计1222篇，严格根据纳排标准进行筛查，最终纳入文献39篇，筛选出治疗肺结节的处方53首，并构建肺结节处方数据库。具体文献筛选和数据库构建流程见图1。

2 中药治疗肺结节的四气、五味、归经频次分析

通过Microsoft office Excel 2019对数据进行规范化后，得到中药213味，用药频次共计914次，22味高频（频次≥10）中药使用最多的是甘草39次（69.64%）、半夏29次（51.79%）、茯苓26次（46.43%），其频次分布与药物类别见表1。213味中药的药性以寒为主（359次，52.58%），温（251次，27.46%）、平（229次，25.05%）次之。药味以苦味和甘味为主，其中苦味452次（30.85%），甘味451次（30.78%）。归经以归肺经（541次，23.77%）、脾经（364次，15.99%）、肝经（347次，14.25%）、胃经（321次，14.10%）最多，见图2。

3 治疗肺结节的中药组方关联规则

利用Apriori函数对213味中药进行关联规则分析，挖掘治疗肺结节的高频药物组合，将最小支持度设置为0.12，最小置信度设置0.8，共得到核心药对组合38个，包含中药15味。38个核心药对组合的统计结果按支持度排序，排名前3的药对为“半夏=>甘草”（支持度0.43）、“茯苓=>甘草”（支持度0.39）、“半夏，茯苓=>甘草”（支持度0.30），见表2、3。运用R语言circlize包对二项关联规则进行可视化（图3），圆上两点的连线来表示2味药的关联性，箭头由前项药物指向后项药物，连线的宽度表示支持度。

4 中药复方系统聚类分析

使用R语言对37味高频中药（频次≥8）进行系统聚类分析，度量区间采用Euclidean距离，聚类方法为ward.D2法，聚类数（k）取7，得到6组多味药物组合和1组药对，见图4。C1类：白术、茯苓、陈皮；C2类（药对）：甘草、半夏；C3类：桔梗、黄芩、紫菀、桑白皮、苦杏仁；C4类：白花蛇舌草、半枝莲、白芍、枳实；C5类：北沙参、鳖甲、麦冬、瓜蒌、玄参、党参、金荞麦、桃仁、薏苡仁、山慈菇；C6类：浙贝母、黄芪、牡蛎；C7类：僵蚕、太子参、莪术、川芎、夏枯草、当归、玄参、柴胡、枳壳、郁金。系统聚类所得的7个聚类组合总体均为扶正祛邪、调畅气血的组合，扶正以补气为主，祛邪以化痰散结为主；体现了肺结节虚实夹杂、气血湿痰阻滞的基本病机。

5 靶点预测

（1） 药物及肺结节相关靶点的筛选

综合药物频次分析、关联规则分析、聚类分析结果，确定“甘草-茯苓-半夏”为核心药物组合，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共获取核心药物组活性成分1991个，甘草、茯苓、半夏的活性成分分别为1769、35、187个。靶点预测发现，甘草238个、茯苓25个、半夏110个，去除重复靶点后共获得253个。通过GeneCards、OMIM数据库检索合并及删除重复靶点后，共获得779个肺结节相关重要靶点。

（2） 核心药物组合治疗肺结节相关靶点的预测

将核心药物组合活性成分靶点与肺结节靶点进行映射，获得甘草、茯苓和半夏治疗肺结节的85个潜在靶点，运用R语言ggplot2包以韦恩图的形式展示，见图5。将核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”与肺结节交集靶点上传至STRING数据库进行PPI分析，得到中药活性成分作用于肺结节的PPI网络，结果显示85个靶标组成的网络中共存在362项相互作用，平均局部聚类系数为0.511，PPI富集P值＜1.0×10−16。将结果导入Cytoscape 3.7.2软件，利用Network Analysis构建高可信度PPI网络（颜色越偏向暖色，表示重要性越大），如图6所示。

结果示网络中各节点的自由度、介度、中心度均超过平均值的靶点有17个，平均度值8.938。以节点度值为评价参数，节点度值越大说明其在PPI网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。自由度排名前10（自由度值≥21）的靶点为信号转导和转录激活因子3（STAT3）、Jun原癌基因（JUN）、蛋白激酶B1（AKT1）、白细胞介素6（IL6）、酪氨酸激酶3（MAPK3）、MAPK1、肿瘤坏死因子（TNF）、肿瘤蛋白P53（TP53）、MAPK14、Fos原癌基因（FOS），表明这些基因在网络中占据重要地位，提示这些靶点可能是“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节发挥功效的关键靶点。见表4。

（3） 核心药物组合治疗肺结节相关靶点的GO功能与KEGG通路富集分析

GO功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括生物过程、细胞组分和分子功能。KEGG富集分析可以得到核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节的靶点所富集的关键通路。将上述核心药物组合治疗PN的共有靶点进行GO富集分析，设定P＜0.01，错误发现率（FDR）＜0.01，选取P值排名前10的功能信息，通过R语言clusterProfiler包进行数据整理，并运用ggplot2包对结果可视化，见图7。

富集比较明显的前10个生物过程包括：DNA结合转录因子活性的调控、上皮细胞增殖、蛋白质定位建立的正向调控、对脂多糖的应答、对细菌源分子的应答、蛋白质转运的正向调节、对氧化应激的反应、细胞因子产生的正调控、对活性氧代谢过程的调节、细胞对生物刺激的反应过程；富集比较明显的前10个细胞组分包括：核染色质、转录因子复合体、RNA聚合酶II转录因子复合物、核转录因子复合体、膜筏、膜微域、膜区、水泡腔、膜小凹、质膜筏；

富集比较明显的前10个分子功能包括：细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、DNA结合转录激活剂活性及RNA聚合酶II特异性、磷酸酶结合、生长因子受体结合、蛋白磷酸酶结合、生长因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性。

通过DAVID数据库进行KEGG通路功能富集分析，并通过R语言ggplot2包实现可视化做图。富集比较明显的前10个通路包括：糖尿病并发症的晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、查加斯病、乙型肝炎、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、癌症中的蛋白多糖、辅助性T细胞17（Th17）细胞分化（Th17 cell differentiation）、人类巨细胞病毒感染、MAPK信号通路、IL-17信号通路、耶尔森氏菌感染（表5、图8）。

（4）中药活性成分-靶点-疾病通路网络图

将核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”的活性成分、靶蛋白及KEGG通路文件用Cytoscape 3.7.2软件构建中药活性成分-靶点-疾病多通路网络图，见图9。运用Network Analyzer分析网络拓扑性质，该网络共有2121个节点，38个活性成分及1034个靶点节点，共有1916条边，结果显示度值大于平均值的前6位（度值＞20）活性成分主要有槲皮素（quercetin，MOL000098）、山柰酚（kaempferol，MOL000422）、黄芩素（baicalein，MOL002714）、柚皮苷（naringenin，MOL004328）、常春藤素（hederagenin，MOL000296）、消旋卡文定碱（cavidine，MOL002670），见表6。

因此可以预测槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）等为中医药治疗肺结节的主要有效成分，这些有效成分具有清除自由基、抑制炎症反应、抗病毒、抗肿瘤活性，改善局部微循环和营养供给，及防治心脑血管疾病、预防癌症等作用。

6 分子对接验证

利用AutoDock Tools 1.5.6对接工具对PPI网络中排名前5的关键靶点与度值最高的前3个主要活性成分进行半柔性对接，以结合能表示小分子与靶蛋白结合的优劣，结合能计算结果如表7所示。通常结合能小于0代表小分子与靶蛋白可自由结合，当结合能≤−5.0 kcal/mol，提示对接靶点与成分间结合性较好。表7中93.33%的结合能小于−5.0 kcal/mol，在一定程度上验证成分-靶点之间的结合活性。结果中黄芩素（baicalein）与MAPK3展示出最好的结合性，见图10，左图为整体视图，右图为局部视图，图中蓝紫色为小分子，淡青色为蛋白，黄色虚线表示氢键作用，灰色虚线表示疏水作用。

讨论

目前，应用低剂量计算机断层扫描（low dosage computerized tomography，LDCT）进行早期诊断是降低肺癌死亡率的首要策略和最有效方法。但需要注意的是，肺结节的早期临床表现不明显，且缺乏有效的治疗手段，对于CT筛查结果为良性肺结节的患者，临床上多以“随访-监测”为主，但循环往复的筛查模式无形中进一步加重了患者的焦虑抑郁情绪和经济负担。

不同医家基于中医动态观与整体观的防治理念，针对肺结节患者不同阶段的需求采用不同治疗思路并调整配伍用药，积累了丰富的肺结节治疗经验，亦为肺结癌转化的长时性空窗期缺乏有效干预措施提供了充足的临床证据。然而，由于缺乏对临床疗效与理法方药间作用关系的具体阐述，未能将肺结节的病因病机认识与组方用药经验进行有效转化，因而中医药治疗肺结节的临床经验尚未形成系统性的诊治理念，而基于数据挖掘方法和现代化的生物信息学技术无疑为高效提取并处理中医药诊治肺结节相关研究中不同过程与阶段的信息提供了有效手段。

值得一提的是，尽管既往有一项类似研究基于数据挖掘初步探索了中医药治疗肺结节的遣方用药规律[14]，但需要指出的是该研究混淆了“肺结节”与“肺结节病”。具体来说，肺结节病是一种病因未明的多系统多器官的肉芽肿性疾病[15]，常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官，通常会有结节性红斑、双肺淋巴结肿大、关节炎、肌肉痛、发烧等典型的临床症状表现；而肺结节则主要依据影像学表现进行诊断，其临床症状不明显，无特异性症状与体征。更重要的是，有必要在挖掘遣方用药规律的基础上进一步深入探索药理学机制和生物信息学基础，以期为后续的中医药干预肺结节临床研究与基础实验提供参考。

既往定性文献总结表明，现代医家多将肺结节的病因病机[16-24]归于气滞痰瘀、虚实夹杂，由正气不足、外邪入侵，导致血疲、气滞、痰浊而产生结节；故以化痰活血、通络散结为基本治法，兼以顾护正气、调畅气机。本研究结果契合了古今医家对肺结节“虚实夹杂、气血湿痰阻滞”病机及以“化痰活血、通络散结为主，兼顾肺脾之气”为基本治则治法的临证认识。首先，肺结节中药复方性味归经统计结果显示，当前临床组方以性寒、味甘苦、归肺经的药物最多，在此基础上得到药物使用频次最高的前3味药物为“甘草”“茯苓”和“半夏”，这也是关联规则中支持度与置信度最高的药物组合（提升度1.36）。

其中，甘草归心、肺、脾、胃经，可补中益气、祛痰止咳；茯苓归心、肺、脾、肾经，善利水渗湿健脾；半夏归肺、脾、胃经，可燥湿化痰、消痞散结，善治脏腑湿痰；核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”共奏补脾益肺、化湿祛痰之功。最后，需要指出既往有研究将甘草视为方剂中调和诸药[25]的配角，通常舍去甘草后探究高频药物组合。然而，本研究发现甘草不仅是关联强度最高和关联节点最多的药物，系统聚类算法将其与化痰药半夏共同归为C2药对，充分说明了甘草在肺结节的中药方剂中不仅是起到调和药性的作用，且现代药理学表明甘草含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类等多种化学成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、调节免疫、抗纤维化等多种药理活性[26-30]，因此，核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节的作用机制与靶点值得进一步研究。

进一步的网络药理学结果揭示核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节的有效成分包括槲皮素、山柰酚、黄芩素等，主要作用于STAT3、JUN、AKT1、IL6、MAPK3、MAPK1、TNF等关键靶点。首先，度值最高的有效成分槲皮素在本研究中的药物来源是甘草，其是一种天然黄酮类化合物[31]，具有清除自由基、抗癌防癌等多种生物活性，可抑制炎症介质生成以影响MAPK信号通路和TNF信号通路等炎症相关信号通路，从而抑制氧化应激及炎症反应[32]。

具体而言，有研究已证实TNF在肺结节炎性病变及抑制扩散过程中发挥重要作用[33]；MAPK3则属于丝裂原活化蛋白激酶家族，其可通过诱导特异性炎症介质、生长因子等与细胞膜受体结合，以激活细胞内MAPK3信号通路，引起细胞增殖和炎症等相关反应，且与肿瘤的发生、发展及侵袭和转移过程密切相关[34-35]。山柰酚是一种抗氧化剂，能帮助防止细胞和DNA氧化损害，有助于预防癌症、防止异变，还能提升癌细胞对化疗药物和抗癌药物的敏感性，并被认为具有预防动脉硬化的功效[36-37]。

另外，黄芩素能够通过清除自由基和抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性、调节炎症细胞因子等途径来调控炎性环境[38-39]。关键靶点中，STAT3的高表达是患者预后不良的有力预测因子[40]，其基因编码的蛋白是STAT蛋白家族的成员。STAT家族成员作为细胞因子和生长因子，被受体相关激酶磷酸化，然后形成同源或异源二聚体，转移到细胞核中，并作为转录激活因子被各种细胞因子和生长因子磷酸化激活[41]，包括表皮生长因子受体（EGFR）、IL5、IL6、肝细胞生长因子（HGF）、白血病抑制因子（LIF）和骨形态发生蛋白2（BMP2）。同时，STAT3基因编码的蛋白介导多种基因在细胞刺激下的表达，在细胞生长和凋亡等许多细胞过程中发挥关键作用[42]，通过阻断细胞凋亡和诱导细胞增殖，控制着细胞的增殖和分化，并参与肿瘤的发生和发展。

此外，IL6作为炎症介质，可直接影响炎症相关信号通路，以抑制炎症的发展[43]。原癌基因JUN和FOS参与多个基因的转录调节，多种细胞外信号可引起其转录激活，控制着细胞的增殖和分化。同时，STAT3还作为JUN、FOS的上游基因，通过磷酸化等途径促使JUN、FOS基因高表达，从而使激活蛋白-1（AP-1）高表达，最终推动细胞的增殖并抑制细胞凋亡，促使肿瘤的生成[44]；另一方面，在多种肿瘤组织中都存在AKT蛋白的过度表达和活化，AKT1是AKT基因的重要亚型之一，已被确定为癌基因，在多种肿瘤组织中都有AKT1基因的扩增，活化的AKT通过发挥介导细胞生长增殖、细胞侵袭、细胞凋亡等方面的作用[45]，参与了多种肿瘤的发生和发展。

选取关键靶点中的STAT3、JUN、AKT1、IL6，与筛选出的关键有效成分槲皮素、山柰酚、黄芩素进行分子对接验证，结果显示核心靶标与关键化合物结合活性良好。黄芩素与MAPK3的M125（蛋氨酸，methionine，Met）形成1个氢键，与V100（缬氨酸，valine，Val）、V56、K71（赖氨酸，lysine，Lys）残基形成了较强的疏水作用。总之，上述关键基因与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭及转移密切相关，在阻延肺结节恶性转化为肺癌中扮演着重要角色。

从GO富集分析结果来看，核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节的生物过程主要定位于核染色质、转录因子复合体、RNA聚合酶II转录因子复合物、核转录因子复合体、膜筏、膜微域等结构，参加DNA结合转录因子活性的调控、上皮细胞增殖、蛋白质定位建立的正向调控、对脂多糖的应答等遗传信息处理与信号传导过程；其分子功能参与了细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、DNA结合转录激活剂活性及RNA聚合酶II特异性、磷酸酶结合等各种信息传递与分解代谢活动，对生物体内的物质运输、DNA复制、细胞生长和死亡等生命活动具有重要作用，并与肿瘤的发生发展、侵袭、转移、耐药及预后不良等密切相关。

KEGG信号通路分析显示，核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”治疗肺结节涉及多种癌症通路、凋亡通路以及各种经典信号通路如Th17细胞分化、IL-17信号通路和MAPK信号通路等。有研究表明[46]，Th17细胞对肺癌有促进和抑制的双向调控作用，与肿瘤微环境和Th17细胞/调节性T细胞比例失衡有关。一方面，Th17细胞分泌的IL-17A介导炎症，同时通过积聚细胞因子，促进内皮损伤、细胞增殖、促进血管生成、抑制肿瘤免疫并增加细胞黏附可介导肿瘤的发生；另一方面，通过分泌特异细胞因子，介导自身免疫反应或者趋化效应性T细胞等方面，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

IL-17家族成员（IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F）可通过其相应受体发出信号并激活下游通路[47-48]，包括核因子-κB（NF-κB）、MAPK和CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP），以诱导抗微生物肽、细胞因子和趋化因子的表达，IL-17信号通路能通过影响细胞的增殖、促进血管的生成及炎性细胞的聚集和活化等多种机制促进癌症的发展[49-50]。“甘草-茯苓-半夏”不仅能够通过诱导多种细胞内信号通路（包括细胞凋亡和细胞存活以及炎症和免疫反应）参与癌症的发生发展进程，还可作用于关键大分子癌症中的蛋白多糖，即肿瘤微环境中的多种蛋白多糖，涉及增殖、黏附、血管生成和转移等在内的肿瘤生物学过程[51-52]，最终影响肿瘤进展。

据此推测核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞血管内皮的增殖和迁移、抑制肿瘤细胞核酸转录等多种机制治疗肺结节并阻延肺的结癌转化进程。此外，核心药物组合“甘草-茯苓-半夏”还可通过参与调控糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路及其他复杂通路与卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、乙型肝炎等病毒通路达到治疗肺结节的目的，对于KEGG富集结果所涉及得多条通路与病毒感染、血管生物学之间的复杂关系需要基于实验研究进一步证实。

结论

本研究运用数据挖掘技术和网络药理学方法，通过对中医药治疗肺结节的组方用药规律进行多角度分析与探讨，初步明确了现代医家对肺结节病机的认识及相关药物配伍规律，进而得到中医药防治肺结节的核心药物组合，即“甘草-茯苓-半夏”；并运用网络药理学方法预测了“甘草-茯苓-半夏”核心药物组合治疗肺结节的潜在靶点、机制通路和生物学过程，通过分子对接技术较好地预测和揭示关键活性成分与靶点之间的三维空间结构和结合活性，为开展临床及基础研究进一步挖掘和探索确切疗效与作用机制提供了数据支撑。

此外，由于不同类型或不同风险分层肺结节不仅在影像学等方面存在固有的特征性差异，亦是影响中医药干预疗效及患者预后转归的重要因素，未来的临床研究应基于中医药辨证施治思想，针对个体化的疾病分型进行精准化和定量化的多角度分层分析，以期形成中医药防治肺结节的系统性诊疗体系和充分明确临床干预策略要点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：董 敬，彭小芸，付 西，任益锋，张龙飞，李林炯，祝 捷，由凤鸣．基于数据挖掘和网络药理学的中医药治疗肺结节用药规律及作用机制分析 [J]. 中草药, 2022, 53(20): 6544-6557 .