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摘 要：目的 基于网络药理学方法和斑马鱼模型探讨瓜蒌薤白半夏汤干预慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriarydisease，COPD）的潜在作用机制。方法 运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医药百科全书数据库（ETCM）、中医药综合数据库（TCMID）以及国内外相关文献检索瓜蒌薤白半夏汤的主要活性成分，通过TCMSP和SwissTargetPrediction数据库预测靶点；通过GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）和TCMSP数据库获取COPD相关靶点，并采用交集法筛选出与瓜蒌薤白半夏汤活性成分作用的共同靶点。运用Cytoscape 3.7.1软件构建“中药-活性成分-靶点”网络，通过String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络；通过DAVID数据库对共有基因进行（，GO）功能富集分析及富集分析；借助斑马鱼炎症模型对筛选的靶点进行实验验证。结果 瓜蒌薤白半夏汤共筛选出成分955个，潜在活性成分106个，核心活性成分如芹菜素、茴香酸、美迪紫檀素、金圣草黄素、香叶木素等74个，对应靶点1134个；PPI网络分析获得瓜蒌薤白半夏汤干预COPD的关键作用靶点408个，包括碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9）、前列腺素内过氧化物合酶1（prostaglandin-endoperoxidesynthase 1，PTGS1）、胰岛素（insulin，INS）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonineprotein kinase 1，AKT1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activatedprotein kinase 1，MAPK1）、MAPK3、血管内皮生长因子A（vascular endothelialgrowth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growthfactor receptor，EGFR）等；GO功能及KEGG通路富集分析得出与瓜蒌半夏薤白汤干预COPD作用相关的生物过程1096个，如炎症反应、细胞溶质、酶结合等；相关信号通路125条，如癌症通路、TNF信号通路、前列腺癌、缺氧诱导因子1信号通路、神经活性配体-受体相互作用等。斑马鱼炎症模型实验结果显示，瓜蒌薤白半夏汤显著降低IL-6、B淋巴细胞2（B-cell lymphoma 2，BCL2）和EGFR mRNA表达水平（P＜0.05），降低半胱氨酸蛋白酶8（Caspases 8，CASP8）mRNA表达水平。结论 瓜蒌薤白半夏汤可能通过作用于EGFR、IL-6、BCL2、CASP8等靶点，调节多条信号通路，从而发挥对COPD的治疗作用。 慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructive pulmoriary disease，COPD）是一种以持续呼吸道症状和持续气流受限为主要特征的临床常见病，通常由香烟烟雾等有害颗粒和气体暴露引起的气道和（或）肺泡异常导致[1]。慢阻肺发病机制复杂，主要与气道和肺慢性炎症、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及细胞凋亡等有关[2]。中医理论中尚无对COPD的明确记载，将其纳入“咳”“喘”“肺胀”等范畴[3]，久病体虚，复感外邪时导致病情不断反复发作或加重进而导致肺胀发生。诸多中医研究者认为肺脾兼虚为导致COPD长期反复发作、病程延长的主要原因。COPD急性发作发生时，如患者未能及时接受有效治疗，可引发心力衰竭、呼吸衰竭等，严重威胁患者生命安全。现有研究表明，COPD的发生发展可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Notch、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-Smad蛋白、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activatedprotein kinases，p38 MAPK）、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）等多条炎症相关信号通路。在COPD的发病机制中，多种促炎和抗炎细胞因子间相互作用，产生了系统性炎症反应，加速COPD的发生与发展[4]。瓜蒌薤白半夏汤出自东汉张仲景的《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证并治第九》：“胸痹不得卧，心痛彻背者，栝蒌薤白半夏汤主之”，全方由瓜蒌、薤白、半夏、白酒（非现代白酒）等药味组成，功擅行气解郁、通阳散结、祛痰宽胸，原方用于治疗胸痹、心痛病属痰瘀痹阻者。然心肺同居于上焦，本方现代亦可用于治疗COPD、创伤性气胸、老年咳喘、慢性支气管肺炎、肺间质纤维化等肺疾病属上述病机者[5]。临床研究表明[6-8]，瓜蒌薤白半夏汤可用于治疗COPD急性发作期患者，能够有效提高临床疗效，改善患者通气状态，从而更好地提高患者的生活质量，但其作用机制尚未阐明。 本研究基于网络药理学方法，系统分析瓜蒌薤白半夏汤干预COPD的有效成分、潜在靶点、作用通路及生物过程等信息，探讨瓜蒌薤白半夏汤干预COPD的潜在作用机制，同时根据网络药理学研究结果对其核心靶点采用斑马鱼模型进行实验验证，为瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 瓜蒌薤白半夏汤中活性成分的收集 通过检索国内外文献关于“瓜蒌”“薤白”“半夏”等活性成分的报道，并利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http:///）[9]、中医药百科全书数据库（ETCM，http://www. tcmip.cn/ETCM/）、中医药综合数据库（TCMID，http://www./tcmid/）[10]等以“瓜蒌”“薤白”“半夏”等关键词搜索，经PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.）[11]验证和整理分类，收集瓜蒌薤白半夏汤中的活性成分。 1.2 潜在活性成分作用靶点的筛选 借助TCMSP和SwissTargetPrediction（http://www./）[12]数据库查询潜在活性成分的靶点，并借助UniProt数据库（http://www. uniprot.org/）[13]等对靶点蛋白名称进行规范化和校正，得到标准化基因靶点信息。 1.3 “中药-活性成分-靶点”网络的构建 将筛选出的靶点、活性成分、药物等信息输入Cytoscape 3.7.1软件（http://www./），构建“中药-活性成分-靶点”网络，导出其相关的度值、中心度值等拓扑数据，并运用“NetworkAnalyzer”功能分析其拓扑学属性。 1.4 COPD相关靶点的获取 以“chronicobstructive pulmonary disease”为关键词，通过GeneCards数据库（http://www.genecards. org/）[14]、OMIM（https://www./）[15]和TCMSP数据库，获得与COPD相关的作用靶点。 1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与分析 利用BioVenn分析工具，将活性成分对应的靶点与COPD相关的靶点进行叠加，取交集，作为瓜蒌薤白半夏汤与COPD关系密切的靶点，导入String数据库（http:string-db.org/）[16]，限定物种为“Homo Sapiens”，去除孤立靶点，以“置信度＝0.4”为条件筛选，获取蛋白相互作用关系。分析结果保存为TSV格式文件，导入Cytosape 3.7.1软件，结合节点度值大小，构建PPI网络。 1.6 靶点通路分析 1.7 实验验证 1.7.1 动物 AB系野生型健康斑马鱼，购自南京一树梨花斑马鱼养殖中心。斑马鱼饲养于斑马鱼专用的养殖系统，在照明14 h、黑暗10 h、28 ℃的标准条件下进行饲养。实验经南京中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号202105A016）。 1.7.2 药材 瓜蒌购自河北安国药材市场，经安徽省农业科学院园艺研究所董玲研究员鉴定为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥成熟果实；薤白（批号180726）购自安徽广和中药股份有限公司，半夏（批号181107）购自安徽六安众信商贸公司，经南京中医药大学严辉博士鉴定分别为百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge.的干燥鳞茎、天南星科植物半夏Pinellia ternate (Thunb.) Breit.的干燥块茎。 1.7.3 药品与试剂 氢化可的松购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；氯仿（批号20171214）购自上海凌峰化学试剂有限公司；乙醇（批号20170327）购自国药集团化学试剂有限公司；异丙醇（批号 1.7.4 仪器 BSG-300型程控光照培养箱（上海博迅实业有限公司）；Axio Vert A1型荧光倒置显微镜（卡尔蔡司光学中国有限公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；EPED-E2-30TF型实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；ML 204型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。 1.7.5 瓜蒌薤白半夏汤的制备 据《金匮要略》原文记载，瓜蒌薤白半夏汤中栝楼实1枚、薤白3两、半夏半斤、白酒1 L；根据《中国药典》及文献研究 1.7.6 分组、造模与给药 将受精后3 d（days postfertilization，dpf）斑马鱼幼鱼置于24孔微量培养板，20只/孔，于28 ℃恒温培养箱培养。设置对照组、模型组和瓜蒌薤白半夏汤（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）组，每组设3个复孔。除对照组外，其余各组加入氢化可的松浸泡6 h后进行切尾；各给药组加入相应药物浸泡4 h后，每组取20个幼鱼收集于1.5 mL离心管，3000 r/min离心10 min，将幼鱼沉于管底，小心吸弃培养液，迅速转移至 −20 ℃冰箱冻存。 1.7.7 qRT-PCR法检测白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、半胱氨酸蛋白酶8（Caspase 8，CASP8）、B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）和表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor，EGFR）mRNA表达情况 按照试剂盒说明书提取斑马鱼中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表1。 1.7.8 数据处理 所有数据以表示，采用SPSS 26软件进行统计学分析，运用成对样本t检验分析组间差异，并用GraphPad Prism软件作图。 2 结果 2.1 瓜蒌薤白半夏汤潜在活性成分的筛选与对应靶点的收集 通过TCMSP、ETCM、TCMID等数据库和文献检索到瓜蒌、薤白及半夏的成分共955个，其中442个来自于瓜蒌、236个来自于薤白、277个来自于半夏。瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分有28种，包括次黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷、腺苷、腺嘌呤5种核苷类成分，掌叶半夏戊、掌叶半夏丁、葫芦巴碱、麻黄碱、去甲哈尔满碱、哈尔满碱、肉叶芸香碱、利用TCMSP平台和SwissTargetPrediction数据库，对活性成分靶点进行预测，74个核心活性成分（表2）共收集到1134个靶点。 2.2 “中药-活性成分-靶点”网络的构建与分析 “中药-活性成分-靶点”网络如图1所示，共包含486个节点（1种疾病节点、3种中药节点、74种活性成分节点、408种靶点节点）和235 710条边。并借助Cytoscape 3.7.1软件中的“Network analyze”功能对网络进行拓扑属性分析，其中度值与中心度值是衡量1个节点在网络中关键性的2个重要参数。选取度值与中心度值较大的节点，这些节点在网络中起到了枢纽作用，可能是关键成分或靶点。以节点度值的平均数作为筛选标准，同时参考其中心度值，筛选出大于平均度值的化合物和靶点作为核心活性成分和核心靶点，共得到44个核心活性成分和143个核心靶点，其中排名前5位的活性成分为芹菜素（apigenin）、茴香酸（anisic acid）、美迪紫檀素（medicarpin）、金圣草黄素（chrysoeriol）、香叶木素（diosmetin），分别能与77、76、70、64、61个靶点发生作用；排名前5的靶点为碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9）、前列腺素内过氧化物合酶1（prostaglandin-endoperoxidesynthase 1，PTGS1）、二肽激肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、EGFR、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，ACHE），分别能与44、36、31、30、30个活性成分相互作用（表3）。 2.3 COPD靶点的收集与PPI网络的构建 通过GeneCards、OMIM和TCMSP数据库共收集到与COPD相关的靶点2071个，与瓜蒌薤白半夏汤相关的1134个靶点进行交集分析后得到408个共有靶点，见图2。将共有靶点信息输入String数据库，将输出结果tsv文件导入Cytoscape 3.7.1软件，构建PPI网络，去除2个独立靶点（ABCC9、MAN1B），网络中共包含406个节点。如图3所示，靶点的平均节点度值为41.38，其中度值大于平均值的靶点有胰岛素（insulin，INS）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、IL-6、白蛋白（albumin，ALB）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factorA，VEGFA）、MAPK1、MAPK3、EGFR、原癌基因SRC、IL-8、CASP3、STAT3、PTGS2、热休克蛋白90 α1（heat shockprotein 90 α1，HSP90A1）、原癌基因HRAS、MAPK8、IL-1β、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）、FOS、TLR4、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、癌基因CTNNB1、癌基因EP300、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR）、MAPK14、沉默信息调节因子2相关酶1（silent information 激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、IL-2等138个，这138个靶点可能是瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的关键靶点，按照度值排序选取排名前30靶点进行结果展示（图3）。 2.4 GO功能及KEGG通路富集分析 2.4.1 GO功能富集分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO条目1096个（P＜0.05），其中生物过程（biological process，BP）条目816个、细胞组成（cellular component，CC）条目88个、分子功能（molecular function，MF）条目192个，分别占74.45%、8.03%、17.52%。按 −lgP值排序，分别选取前10条目，见图4。BP中靶点主要涉及炎症反应、药物反应、细胞凋亡负调控、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）反应；CC中靶点主要涉及细胞溶质、质膜、细胞表面；MF中靶点主要涉及酶结合、药物结合、三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）结合、蛋白结合等。 2.4.2 KEGG通路富集分析 通过使用DAVID数据中KEGG通路富集分析得到125条（P＜0.05）信号通路，按照 −lgP值排序，选取前20条目，绘气泡图，见图5。主要涉及癌症通路、TNF信号通路、前列腺癌、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、神经活性配体-受体相互作用等通路，主要涉及INS、AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、MAPK3、MAPK1、EGFR、SRC、CXCL8、CASP3、STAT3和PTGS2等靶点。 2.5 qRT-PCR法检测斑马鱼模型IL-6、CASP8、BCL2和EGFR mRNA表达情况 网络药理学结果表明，炎症相关靶点及通路是瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的关键，通过建立斑马鱼炎症模型对筛选出的炎症靶点EGFR、IL-6、BCL2、CASP8进行实验验证。如图6所示，与对照组比较，模型组IL-6、CASP8、BCL2和EGFRmRNA表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，瓜蒌薤白半夏汤（200 μg/mL）组IL-6、BCL2和EGFRmRNA表达水平显著降低（P＜0.05），瓜蒌薤白半夏汤（100μg/mL）组BCL2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；瓜蒌薤白半夏汤各剂量组CASP8 mRNA表达水平降低，但无统计学意义。与网络药理学研究结果一致，瓜蒌薤白半夏汤主要通过调节EGFR、IL-6、BCL2、CASP8等靶点干预COPD。
3 讨论 本研究采用网络药理学方法共筛选出瓜蒌薤白半夏汤中成分955个，考虑到汤剂煎煮对中药的影响选取潜在活性成分106个、核心活性成分74个，作用于1134个靶点，干预COPD的关键作用靶点408个，体现了中药多成分、多靶点、整体性和关联性的特点。根据“中药-活性成分-靶点”网络的拓扑属性分析结果，进一步得到其中排名前5位的活性成分分别为来自于瓜蒌的芹菜素、美迪紫檀素、金圣草黄素、香叶木素和来自于半夏的茴香酸。 黄酮类成分在瓜蒌薤白半夏汤干预COPD中起到了较为重要的作用。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫等药理作用，其中抗炎和抗氧化活性使其成为预防和治疗肺部炎症疾病的潜在药物[22]。芹菜素具有抗氧化、抗炎及保肝等作用。芹菜素碳苷可通过抑制TLR4/瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（transient receptor potential cationchannel 6，TRPC6）信号通路的激活来抑制急性炎症和细胞凋亡，从而抑制LPS诱导的BALB/c小鼠急性肺损伤模型的肺部炎症[23]。芹菜素可以降低CD4＋和CD8＋T细胞、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性来调节炎性反应和氧化应激水平，从而逆转百草枯诱发的急性肺损伤[24]。金圣草黄素可显著抑制LPS诱导的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）产生和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）表达，进一步抑制NF-κB和活化蛋白1（activator protein 1，AP1）等表达；金圣草黄素显著抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中TLR4和髓样分化蛋白88等接头分子活化[25]。研究表明，肺部炎症损伤的大鼠中TLR4表达水平升高，为维持COPD炎症反应的主要TLRs[26]。香叶木素能够降低肺湿/干质量，以及支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β等蛋白表达水平[27]；此外，香叶木素还能够显著抑制LPS诱导的髓过氧化物酶、丙二醛和活性氧水平的升高，并通过激活核因子相关因子2（nuclearfactor E2-related factor 2，Nrf2）以及抑制结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrindomain- containing protein 3，NLRP3）炎症小体，保护LPS诱导的急性肺损伤。 PPI网络分析和“中药-活性成分-靶点”网络的拓扑属性分析结果表明，瓜蒌薤白半夏汤干预COPD的主要作用靶点为CA9、PTGS1、PTGS2、INS、AKT1、IL-6、TNF、CXCL8、EGFR、VEGFA、MAPK3、MAPK1、MAPK8等。CA9是非小细胞肺癌中的重要分子，参与一系列血管生成、细胞凋亡和细胞间黏附破坏的蛋白表达[28]。研究表明，气道炎症是COPD发生发展的重要机制，COX2是花生四烯酸代谢过程中的重要限速酶，香烟烟雾暴露能够上调COX2表达，而其代谢产物可加剧患者的气道炎症反应，导致气流阻塞程度增加。此外，细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β在COPD患者中表达上升，均可诱导气道炎症的发生，造成气道与肺组织持续性的损伤[29-30]。CASP3、CASP8属于半胱氨酸蛋白酶家族，与细胞凋亡有关。CASP8介导死亡受体途径，并激活CASP3，被激活的CASP3作用于BCL2家族成员，破坏宿主细胞内的结构蛋白及DNA稳定，最终导致细胞凋亡[31-32]。烟雾引起的COPD通过激活细支气管上皮细胞CASP3的免疫反应，从而介导细胞凋亡[32-33]。VEGFA是血小板源性生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）/VEGF生长因子家族的成员，可以诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡，增加血管通透性和调节血栓形成。BCL2与凋亡调节和肺功能有关[34]，可通过维持线粒体膜电位介导细胞凋亡，从而促进COPD的发展。肺气肿型COPD患者的肺组织中VEGF和BCL2蛋白表达明显降低，提示瓜蒌薤白半夏汤可通过上调VEGF和BCL2表达，VEGF进一步作为内皮细胞存活因子，保护内皮细胞。瓜蒌薤白半夏汤能够显著降低斑马鱼炎症模型EGFR、BCL2 mRNA表达水平，且呈剂量相关性。KEGG通路富集主要涉及癌症通路、TNF信号通路、神经活性配体-受体相互作用等通路，靶点富集数目最多的通路为癌症通路，且均涉及IL-6。IL-6是一种促炎因子，可通过趋化炎性细胞聚集和促进炎性细胞浸润，加速肺纤维化早期的肺泡炎症反应，进而介导特发性肺纤维化的发生，对肺部产生损伤[35]。瓜蒌薤白半夏汤对病毒感染及肺部损伤具有一定的干预作用，瓜蒌薤白半夏汤能够显著降低斑马鱼炎症模型IL-6 mRNA表达水平，且呈剂量相关性。此外，TNF信号通路在抗病毒、介导能量代谢、炎症反应、血管生成以及维持干细胞特性等方面发挥重要作用，HIF-1信号通路与免疫反应、炎症反应的发生与发展密切相关[36]。 综上所述，瓜蒌薤白半夏汤中芹菜素、茴香酸、美迪紫檀素、金圣草黄素、香叶木素等74个核心功效成分作用于CA9、PTGS1、INS、IL-6、AKT1、TNF、MAPK1、MAPK3、VEGFA、EGFR等408个靶点，通过炎症反应、细胞溶质、酶结合等1096个生物过程，癌症通路、TNF信号通路、前列腺癌、HIF-1信号通路、神经活性配体-受体相互作用等125条信号通路，从而治疗COPD。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来 源：谈晓莹，李 丹，刘 培，冯伟萌，武文星，刘嘉庆，宿树兰，郭 盛，尚尔鑫，张黄琴，段金廒．基于网络药理学及斑马鱼模型的瓜蒌薤白半夏汤干预慢性阻塞性肺疾病的作用机制研究 [J]. 中草药, 2021, 52(17): 5233-5243 .
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