【原】使用Clock Scan工具分析荧光图片

解螺旋 2020-08-27

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解螺旋公众号·陪伴你科研的第1849天

ImageJ和荧光绝配哦~

ImageJ（https://imagej./ij/）是由NationalInstitutes ofHealth（NIH）开发的一款基于Java的公共的图像处理软件，在生物及医学图像分析中起着重要作用。下图是ImageJ官网的界面，在Download下根据自己系统选择对应的软件下载，ImageJ可以适用于MacOS X，Linux以及Windows系统（不受电脑系统及版权限制）。

今天给大家分享免疫荧光分析的常见方法。

Plot Profile分析荧光共定位

之前给大家分享过使用Plot Profile分析荧光共定位，如下图所示：

上图表示两个蛋白都定位于轴突或树突。我们还需注意荧光拍摄过度曝光问题，我们知道灰度值0是纯黑，灰度值255为纯白。

对于上图rab7-GFP与beclin1，随着distance变化有一段图像是平的，从纵坐标可以看出大概在255左右，说明此处存在过曝。简单来说本来灰度有差异的荧光点都变成了饱和的最大值255，也许有些值本来是233也变成了255，差异就不会被显现出来，因此荧光图片拍摄不能过曝。因此，PlotProfile除可以表示荧光共定位外也可判断荧光图片有无过曝。

Plot Profile工具在ImageJ菜单下Analyze下（快捷键Ctrl+K）。划线工具或者矩形工具分别对对应荧光通道进行Plot Profile，可得到直线或矩形范围内荧光强度变化，导出数据绘图即可。

Clock Scan分析荧光共定位

Plot Profile得到的是沿着直线或矩形框内的荧光强度变化。那么如果要分析径向的荧光强度变化该如何分析？那就轮到今天的主角Clock Scan闪亮登场了。径向的荧光强度指的是某个ROI（感兴趣区）的中心分析其从中心至ROI外周的径向平均强度变化：

Clock Scan插件的下载与安装：

https://pan.baidu.com/s/1jRtuDZirZYbo04T8Dwu_hQ提取码:7kba。

将Clock_Scan-1.0.1.jar与Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar放入ImageJ文件plugins文件夹下，重启软件即可。

Clock Scan插件视频教程：https://www./video/55819/。

ROI的绘制

（1）使用ImageJ打开感兴趣的图像：File，Open菜单。

（2）单击多边形工具（polygon）或分段直线选择（segmentedline selection）工具，然后在图像上绘制整个ROI或该区域的一部分轮廓。有关多边形选择的示例(内部虚线轮廓)：

注意：ROI绘制方法种，软件中提供的其他选择工具(矩形、椭圆形和徒手选线)也可以使用。

（3）打开ROIManager：点击Analyze，Tools，ROIManager。点击Add添加ROI：

在ROIManager下More中点击Specify：

Specify下可以调整ROI中心点的坐标以及形状的长和宽。例如绘制一个直径为300像素的正圆：

调整中心的XY坐标可以移动上述画好的正圆：

Clock Scan

添加ROI如下：

ImageJ文件plugins点击Clock_Scan，插件界面如下：

一一对Clock_Scan插件的设置内容进行介绍：

Xcenter与Ycenter可以调整ROI的中心点位置：

Scanlimits表示扫描应在任何给定方向上超出ROI边界的距离的倍数；默认值为1.20，表示扫描长度将比扫描方向上的半径长20%（下图外圈）：

输出内容选项如下：

选择需要分析的通道，可分析总的灰度值（Grey）与R、G、B三通道：

设置好分析参数后得到以下结果：

红绿蓝分别代表三个通道的径向荧光强度分布，灰色代表平均荧光强度分布。点击List可以得到分析数据：

File，Saveas可以导出分析数据，使用Origin或Graphpadprism绘图即可。

与Clock_Scan类似，Multi_Clock_Scan可以同时分析多个ROI：

Clock_Scan插件的应用实例

实例1：

下图是差分干涉对比显微镜(DIC)拍摄的背根节神经元的图像。使用荧光显微镜监测刺激前后不同的时间间隔（单位为ms）的细胞内钙离子浓度。

实例2：

不同脑区神经元分布：

其他Clock Scan的功能就有待聪明的你来使用啦！今天给大家分享使用Clock Scan工具分析荧光图片就到此为止了，希望对大家有所帮助。

参考文献：

Dobretsov,Maxim, Georg Petkau, Abdallah Hayar, and Eugen Petkau. 2017. “ClockScan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins.” Journal ofVisualized Experiments, no. 124 (June). MyJove Corporation.doi:10.3791/55819.

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