使用imageJ进行荧光图片的共定位分析、荧光强度profile，胞浆比的计算！

作为科研工作者，跟荧光图片打交道是常有的事，蛋白定位，定量等等数据是组成大多数论文不可缺少的部分。面对荧光图片的处理，你是不是有过一筹莫展的时候。别在苦恼了额，今天我们来讲讲强大的ImageJ是如何帮你处理荧光图片。

ImageJ是基于JAVA的图像处理软件，由NIH开发。ImageJ界面十分简单明了，且免费、开源。如下图，打开的图片也是由单个窗口呈现。

图1.ImageJ操作界面以及打开两幅小鼠8cell时期的核染胚胎荧光图片。

一、使用直线工具操作荧光强度profile

（1） 首先，我们点击file  open打开想要分析的荧光图片，或者直接拖动图片到ImageJ。以图1中1来介绍具体操作流程。

（2） 点击工具栏中直线工具成激活状态

                 
图2：直线工具

（3）在图目标区域，画一条直线。

图3：在目标区域画直线

（4）到了关键的一步：找到Analyze菜单，点击，有个下拉菜单，找到Plot Profile，点击。

图4： 点击Analyze下拉菜单中的Plot Profile

（5）ImageJ弹出一个关于以线起点到终点为距离的X轴以及相应的灰度值的窗口。这样，我们可以很明了的看出灰度的变化趋势。其中窗口下面“LIVE”按钮可以实时查看结果，点击“list”按钮，可以弹出具体X、Y数值的结果窗口，也可以点击“Save”按钮，保存以excel文件的数据。如下图：

图5：距离与灰度值二维的结果图

图6：具体X, Y轴数据

图7：点击Save后保存的Excel数据

（6）可以利用excel作图，使图形更加美观（这里没有具体调节图形，只调节个别细节，excel作图不再赘述。

图8：excel对结果的作图

二、使用imageJ进行共定位分析

有小伙伴说直线工具分析灰度值使用的少，其实这是一种错误的想法，imageJ的强大在于它可以处理很多问题，从生物学到医学，软件上有很多工具可以使用，另外还有很多来自全球各地imageJ粉开发的插件，但针对特定人群用于特定图片的分析，使用的就是特定的几种工具了。上面的所说的直线分析荧光profile应用比较多的是一个区域内荧光强度由弱到强（或者由强到弱）的变化趋势，比如卵母细胞中线粒体由接近膜胞质区到接近中心的胞质区分布是变化的，而这种分析的效果是矩形工具或者椭圆工具很难达到。

1. 首先，我们点击file + open打开想要分析的荧光图片，或者直接拖动图片到ImageJ。我们以图1两幅图片来介绍具体操作流程。

   

   图1.ImageJ操作界面以及打开两幅小鼠8cell时期的核染胚胎荧光图片。

2. 将两幅图片变成图像栈，image — stacks  — images to stack，图2，这是我们可以滚动新窗口下面的滚动条可以看到两幅图片集中在一个窗口里面，图3。

   
   图2.图片到图像栈
   

   
   

   图3.通过滚动条查看两幅图片在一个图像栈里

3. 点击工具栏中直线工具成激活状态。

图4.激活直线工具

4.  我们任意在图像栈中的一幅图片中画一条直线，我们发现两幅图都会出现相同的直线。

图5.目标区画直线

5.  同样地，我们在Analyze菜单下，点击Plot Profile。

图6. Plot Profile在Analyze下拉菜单中

6.  ImageJ弹出一个关于以线起点到终点为距离的X轴以及相应的灰度值的窗口。这样，我们可以很明了的看出灰度的变化趋势，图像栈中每一幅图片都有对应结果，当我们滚动滚动条转换不同图片的时候，点击“live”，结果就会弹出来。点击“list”按钮，可以弹出具体X、Y数值的结果窗口，也可以点击“Save”按钮，保存以excel文件的数据。

图7. 图像栈中每幅图对应的距离与灰度值二维的结果图

图8.分别点击“list”，得到相应的X， Y轴数据

图9.点击Save保存excel数据。

7.  我们可以利用excel作图，使图形更加美观（这里没有具体调节图形，只调节个别细节，excel作图不再赘述，图10。图中，我们可以看出代表red，blue两种染料有共定位的现象。

图10. excel对结果的作图。

如何分析荧光图片核浆比？

今天以 2011 年 PLoS ONE 发表文献中图片为例，给大家分享：

简单总结一下核浆比的过程，对单个细胞来说得到某荧光信号在胞浆和胞核分别有多少，在 Excel 进行 ratio 比值即可。

步骤如下：

1. 打开 ImageJ 软件，File，Open 打开待分析图片：

打开图片可在图片左上角看见其大小：134x128 pixels，格式为 RGB，大小为 67K。图像的格式千差万别，分类也有很多。

Imagej 支持的格式有：TIFF、GIF、JEPG、PNG、DICOM 和 BMP 等。TIFF 格式是目前最复杂的一种位图文件格式，是通用的图像文件，是 Imagej 默认的格式，可以是 1 位、8 位、16 位（无符号）、32 位（真彩）。

计算机显示一幅图片时，通过三种基本颜色（R-红、G-绿、B-蓝）构成，既通常所说的 RGB 真彩模式。荧光图片的格式一般为 GRB Color 模式。

2. 拆分 RGB 通道

Image -> Color -> Split Channels

得到 RGB 三通道（注意此时 RGB 通道均为灰度显示）：

因为示例图片无红色（Red）通道故 R 通道为黑色。

3. 合并已拆分通道

Image -> Color -> Merge Channels

出现如下界面，将相对应的通道选择相对应的图片。

下面的三个选项：

• Create composite，创建一个合成图片；

• Keep source images，保留源图片；

• Ignore source LUTs，忽略源图片本身的伪彩。

点击 OK，得到 Merge 合成后的图片： 

 

可用鼠标或者滚轮进行通道条码变换，分别对应 G, B 通道。在图片左上角也可以看见 c：1/2……等相对应的通道信息。

合并为多通道图片后再次拆分通道即可得到带有伪彩的单通道照片，Image -> Color -> Split Channels：

4. 灰度值与光密度值的关系

纯黑灰度值为 0，纯白灰度值为 255，0-255 之间即为灰。灰度值为 255，纯白处 OD 值为 0，即光 100% 投射没有任何物质。

理论上 OD 值是从 0 无穷大。因为值随光源强度改变而改变，是发射幅度和入射幅度功率比值的一部分，实际应用中，OD值的范围常用 0-2.71。

那么此处我们应该使用「灰度值分析」 OR「OD 值分析」呢？

答案是都可以。因为我们最终得到的是核浆比，比值是没有单位的。

差别在于，荧光图片背景为黑色，灰度值为 0，荧光越强，灰度值越大。如果分析光密度值，那么必须将图片反转，不然荧光越亮，OD 值反而越小。

5. 计算核浆比

用 OD 值需要在 Eidt ->Invert 后，Analyze，Calibrate，选择 Uncalibrate OD 即可校准灰度值为 OD 值。

图中两个细胞有一些连接，以左边入核明显细胞为例。首先使用不规则选框将左边细胞框选中：

Analyze->Tools->ROI manager（感兴趣区管理器），点击 Add：

• 调整参数：在软件 Analyze 下选择 Set Measurements 设置测量参数，选择 Integrated density，Area，Limit to threshold等，Threshold 调节阈值，红色代表选中，选择 Limit to threshold 只计算红色选择的面积，点击 OK。

• 调节阈值：Image -> Adjust -> Threshold ，选择所有阳性信号（红色代表选中）：

Analyze，Measure（快捷键 Ctrl+M），得到结果：

黄色 ROI 中的红色的灰度值总和为 177096，黄色中的红色占黄色面积的 51%。

如果不加黄色 ROI，进行同等条件的测量：

得到的结果不仅仅只有左边这个细胞，其灰度值总和为 254633，大于 177096，红色占整张图片的面积百分比为 14.9%，远远小于 51%。

此时我们已经得到单个细胞总的荧光强度（灰度值）A  = 177096。接下来需要计算核内的荧光强度 B，用总的荧光强度 A-B 得到胞浆荧光强度 C。

对细胞核图片同样进行 Image -> Adjust -> Threshold 调节阈值，选择所有阳性信号：

Analyze -> Analyze particles 界面如下：

Size(pixel^2): 默认为 0-Infinity（无穷大），意思是需要计算的细胞数的细胞大小在哪个区间，比如在此 Dapi 的细胞大小选择为 500-Infinity，将不是计数目标的杂志点过滤掉，在此我们需要根据目的细胞的大小来试几个最小值就能得到准确的细胞计数结果。

下面勾选的是： 

• Display results，显示结果。

• Add to Manager：测量粒子添加到 ROI 管理器。

在此我们选择 Add to manager，添加结果至 ROI manager：

ROI-3 是我们需要分析的细胞核，在上述已经阈值选定的绿色荧光通道中点击 ROI-3 可在图中显示细胞核轮廓：

Analyze，Measure（快捷键 Ctrl+M），得到核内的荧光强度 B：

核浆比 = B/(A-B)= 98684/(177096-98684)= 1.26

得到的结果 1.26 与文中是否相近？在文中该细胞的核浆比如何：

由统计图可知 GFP-PEDF 核浆比在 1-1.4 之间，说明了我们计算的这一个细胞核浆比的准确性。

参考文献：

1. Lin, L., Cao, J., Yang, S. S., Fu, Z. Q., Zeng, P., Chu, J., … Wang, J. Z. (2018). Endoplasmic reticulum stress induces spatial memory deficits by activating GSK-3. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 22(7), 3489–3502. https:///10.1111/jcmm.13626

2. Anguissola, S., McCormack, W. J., Morrin, M. A., Higgins, W. J., Fox, D. M., & Worrall, D. M. (2011). Pigment epithelium-derived factor (PEDF) interacts with transportin SR2, and active nuclear import is facilitated by a novel nuclear localization motif. PLoS ONE, 6(10). https:///10.1371/journal.pone.0026234

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