【神经免疫】抗γ-氨基丁酸A型受体脑炎：以癫痫为突出表现的新型自身免疫性脑炎

文章来源：中华神经科杂志，2019,52(2):85-91

作者：邓波 章彤彤 陈向军 张金宝 刘小妮 张祥 俞海 初曙光 竺淑佳

摘要

目的

在国内首次报道抗γ-氨基丁酸A型受体（GABA_AR）脑炎的临床特征、诊断及对免疫治疗的反应，从而引起神经科医生对该种新型自身免疫性脑炎的重视。

方法

采用基于活细胞的间接免疫荧光法检测临床怀疑为自身免疫性脑炎、但现有自身免疫性脑炎相关抗体阴性患者血清与脑脊液中的抗GABA_AR抗体。收集并分析2例2013—2014年在复旦大学附属华山医院神经科住院并诊断为抗GABA_AR脑炎患者的临床表现、辅助检查及治疗情况。

结果

2例患者的血清和脑脊液均存在抗GABA_AR抗体。2例患者以癫痫起病或病程中存在难治性癫痫，同时有记忆障碍、精神行为异常、意识障碍等临床表现。其中1例患者合并前上纵隔占位。2例患者头颅磁共振成像均表现为皮质及皮质下多发异常信号灶。单纯抗癫痫药物治疗抗GABA_AR脑炎效果不佳，但加用免疫药物后治疗有效。

结论

抗GABA_AR脑炎以显著癫痫及颅内多发病灶为突出特征。识别上述特征对诊断该病具有提示意义。基于细胞的间接免疫荧光法可用于该病中特异性自身抗体的检测，从而及早确诊该病。及时采用免疫治疗对改善患者病情与预后十分重要。

γ-氨基丁酸A型受体（γ-Aminobutyric acid type A receptor，GABA_AR）是中枢神经系统最重要的一类抑制性离子型通道受体，主要参与快速抑制性突触信号的传递。2014年Dalmau团队首次发现部分自身免疫性脑炎患者体内存在特异性抗GABA_AR的自身抗体，并命名这种新型的自身免疫性疾病为抗GABA_AR脑炎^[1]。目前国内尚无抗GABA_AR脑炎的文献报道。我们利用HEK293T细胞转染表达GABA_AR，并采用基于活细胞的间接免疫荧光方法检测患者血清及脑脊液中抗GABA_AR抗体的存在。利用上述检测方法我们团队在临床疑似的自身免疫性脑炎患者中成功检测出2例抗GABA_AR抗体阳性的病例。现对其临床特征及诊疗经过进行报道，同时结合既往文献报道对该病进行分析，以提高国内临床医生对此类新型自身免疫性脑炎的认识。

资料和方法

一、一般资料

2例抗GABA_AR抗体阳性患者均为复旦大学附属华山医院神经科住院治疗的患者。其临床资料如下：

例1　男性，18岁。因'反复四肢抽搐伴记忆下降、精神行为异常5个月'于2014年5月9日入院。患者5个月前受凉后出现发热，伴头晕头痛、视物旋转、恶心呕吐。随后患者出现记忆下降，以近事记忆下降为主，伴右侧肢体麻木、乏力及右耳听力下降。起病5 d后患者突发四肢抽搐，意识丧失，持续3~4 min缓解。患者遂就诊当地医院，查血常规示白细胞不高，血单纯疱疹病毒及EB病毒抗体均阴性。头颅磁共振成像（MRI）平扫及增强提示：左侧顶叶及颞叶异常信号影。脑脊液检测提示：白细胞6×10⁶/L，余常规及生化检查均在正常范围。脑脊液未找到抗酸杆菌及隐球菌。进一步查安静及运动后血乳酸水平、肌肉活体组织检查（活检）无明显异常。考虑'症状性癫痫，脑炎或线粒体脑肌病待排'，予抗病毒、抗癫痫及脱水、降颅压等治疗。患者肢体抽搐症状未见明显好转，且病情加重，出现烦躁不安、胡言乱语、表达困难及意识不清。并因频繁癫痫发作，考虑癫痫持续状态，予气管插管，继之气管切开，呼吸机辅助呼吸。联合地西泮、苯巴比妥、丙戊酸钠、卡马西平、托吡酯等抗癫痫治疗后患者病情逐渐平稳，意识好转，四肢抽搐次数减少。予以带托吡酯、卡马西平、左乙拉西坦、氯硝西泮等药物出院。出院时仍有口角及双上肢间断抽动，言语障碍，听力下降，双下肢无力及发作性呃逆。出院2个月患者抗癫痫药物减量后再次发生四肢抽搐，意识丧失。再次住院治疗，复查头颅MRI提示：双侧额叶、枕叶及顶叶多发斑片状及大片状等T₁长T₂信号，增强未见强化。给予托吡酯及丙戊酸钠加量抗癫痫治疗。但患者仍频发口角及双上肢抽动，每1~2 d大发作1次，每次持续3~4 min缓解。患者为进一步诊治收入我院。病程中患者精神差，睡眠一般，食欲可，大小便正常，无体重明显下降。

既往史：既往体健。出生史及发育史正常。否认高血压、糖尿病及传染病史。无外伤及手术、输血史。否认食物、药物过敏史。发病前无疫苗接种及肠道感染史。无放射、毒物、毒品接触史。无吸烟、饮酒史。未婚未育。家族无近亲结婚，父母均体健。

体格检查：嗜睡，表情呆滞，言语不清，高级认知功能检查不配合。口角及双上肢可见持续抽动。脑神经检查无阳性体征。四肢无肌肉萎缩。双上肢近端肌力Ⅳ级，远端肌力Ⅲ级。双下肢近端肌力Ⅴ级，远端肌力Ⅳ级。肌张力正常。双侧共济运动及感觉检查不合作，右侧膝反射亢进，双侧掌颌反射阳性，右侧巴宾斯基征阳性。脑膜刺激征阴性。不能独立站立及行走。

例2　男性，25岁。因'四肢抽搐1次，发现颅内及纵隔占位1个月余'于2013年7月16日入院。患者1个月余前活动中突感四肢活动不灵，1 d内有3次类似发作，患者未在意。2 d后患者突发四肢抽搐、意识丧失，约15 min后意识恢复。后患者几乎每日出现发作性头胀痛伴恶心、皮肤起'鸡皮疙瘩'及行走不稳。偶尔有右侧肢体僵硬感。至当地医院就诊，行头颅增强MRI提示：左侧海马及左侧镰旁额回肿胀。脑电图提示：异常动态脑电图。脑脊液常规、生化检查未见明显异常。胸部CT示：前纵隔肿块，伴右侧气管食管沟肿大淋巴结。纵隔肿物穿刺活检印片示：淋巴细胞、少量机械损伤严重的似上皮细胞，倾向肿瘤性。细胞病理检查示：肿瘤性病变不除外。给予卡马西平及丙戊酸钠控制癫痫，同时予以抗病毒及脱水等治疗。后患者无再发抽搐，每日发作性症状也有所缓解，但仍有头晕。入院前1周患者自觉语速减慢，记忆减退，味觉减退。为进一步诊治收入院。自发病以来，精神睡眠较差，饮食及大小便如常，体重无明显下降。

既往史：既往体健。出生史及发育史正常。无高血压、糖尿病及传染病史。无外伤及手术输血史。无放射、毒物、毒品接触史。无吸烟、饮酒史。已婚已育，父母、配偶及子女均体健。

体格检查：意识清楚，精神稍烦躁，言语表达欠佳。记忆力、计算力减退。味觉减退，以甜味减退为主。余脑神经检查及感觉、运动、腱反射、共济检查均无阳性体征。双侧病理征阴性。脑膜刺激征阴性。

二、抗GABA_AR抗体的检测

将HEK293T细胞以0.2×10⁶/孔的密度种于放置细胞爬片的24孔培养板，用含10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco′s modified Eagle medium）培养基（Gibco公司，美国）在37 ℃、5% CO₂的培养条件下培养。待细胞密度长至90%左右时，采用聚乙烯亚胺转染法共表达含有α1、β3、γ2 3个亚基的GABA_AR。α1和γ2质粒融合表达了红色荧光蛋白mRuby。转染后8 h换液，待换液36 h后吸去培养基，用细胞外液（145 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl₂，5 mmol/L葡萄糖，0.01 mmol/L甘氨酸，5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH=7.4）洗3次，然后将患者血清（用细胞外液1∶10稀释）或脑脊液（1∶1稀释）加入，室温摇床孵育20 min。细胞外液洗3次，加入Alexa Fluor 488荧光素标记的山羊抗人IgG二抗（Molecular probes公司，美国；稀释比1∶800），室温孵育20 min。细胞外液洗3次后用4%多聚甲醛室温下固定5 min。磷酸盐缓冲液洗3次后吸去多余液体，晾干玻片，甘油封片后置于激光共聚焦显微镜下观察。以神经系统非炎性疾病患者脑脊液作为对照。

三、自身免疫性脑炎相关抗体及肿瘤神经抗体检测

自身免疫性脑炎相关抗体谱（包括抗N-甲基-D-天冬氨酸受体、抗α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸1型及2型受体、抗接触蛋白相关样蛋白2受体、抗富亮氨酸胶质瘤失活蛋白1受体及抗γ-氨基丁酸B型受体）及肿瘤神经抗体谱[包括抗Hu、Yo、Ri、两性蛋白（amphiphysin）、Ma2以及CV/CRMP5]采用商业试剂盒（EUROIMMUN公司，德国）检测，检测操作按试剂盒使用说明进行。

四、常规实验室检查及其他病因筛查

患者入院后行血、尿、粪、肝肾功能、电解质及感染相关指标等常规实验室检查及脑电图、肌电图、风湿免疫自身抗体、病原学、线粒体DNA突变检测等以辅助诊断及筛查其他可能的病因。

结果

一、常规实验室检查及病因筛查

2例患者入院后查血、尿、粪常规和肝肾功能、电解质、红细胞沉降率、C反应蛋白无明显异常。HIV抗体、梅毒快速血浆反应素试验阴性。抗核抗体及可提取性核抗原抗体谱、抗中性粒细胞胞质抗体、抗心磷脂抗体、抗线粒体抗体均阴性。结核分支杆菌感染T细胞斑点试验、血清寄生虫抗体均阴性。例1甲状腺相关自身抗体均阴性，例2甲状腺球蛋白抗体弱阳性。此外，例1血乳酸检测阴性。线粒体DNA突变检测阴性。肌电图无明显异常表现。脑电图示：双侧可见大量θ波、δ波、尖波、尖慢波，右侧呈持续发放明显。例1入院后查脑脊液常规正常，生化检查示蛋白略升高，糖及氯化物正常。脑脊液脱落细胞未见异常。例2入院后脑脊液常规及生化检查均在正常范围。

二、影像学检查

例1头颅MRI提示：双侧大脑半球多发皮质及皮质下病变（图1）。头颅磁共振波谱提示炎性病变可能，头颅CT血管造影未见明显异常。例2头颅增强MRI提示：双侧大脑弥漫多发异常信号影，无明显强化（图2A，图2B，图2C，图2D）。头颅磁共振波谱提示肿瘤证据不足。

图1 抗γ-氨基丁酸A型受体脑炎患者例1头颅磁共振成像（MRI）表现。头颅MRI显示顶叶、额叶及颞叶多发的片状T₂-液体衰减反转恢复序列高信号病灶。灰质受累为主，也有白质受累表现。病灶的水肿及占位效应较轻

Figure 1 Brain magnetic resonance imaging (MRI) of case one. The brain MRI of this patient showed multiple areas of T₂-fluid attenuated inversion recovery abnormal high signal involving parietal, frontal and temporal lobes. Grey matter was predominantly involved, and white matter was also affected. Edema and mass effects were not obvious

图2 抗γ-氨基丁酸A型受体脑炎患者例2免疫治疗前后头颅磁共振成像（MRI）表现。患者免疫治疗前的头颅MRI显示顶叶、枕叶、额叶及颞叶多发的皮质及皮质下T₂-液体衰减反转恢复序列高信号团块状病灶（A~D）。激素冲击治疗2周后复查MRI显示病灶数减少，但也有少量新发病灶出现（E~H）

Figure 2 Brain magnetic resonance imaging (MRI) of case two before and after immunotherapy. The brain MRI of this patient showed multifocal cortical and subcortical high T₂-fluid attenuated inversion recovery signal involving parietal, occipital, frontal and temporal lobes before immunotherapy (A-D). Two weeks after high dose methyl prednisone treatment, these high signals diminished, whereas a few new sites appeared (E-H)

三、肿瘤筛查

对例1行胸部CT检查未见纵隔占位性病变。例2行胸部增强CT示：前上纵隔占位，考虑胸腺瘤来源的恶性肿瘤可能，胸膜、腹膜多处软组织密度突起，考虑转移不除外。结合患者外院穿刺病理结果首先考虑胸腺瘤。2例患者血清肿瘤标志物均未见明显升高。

四、自身免疫性脑炎相关抗体及肿瘤神经抗体谱检测

2例患者送检目前可常规临床检测的自身免疫性脑炎相关抗体及肿瘤神经抗体谱均阴性。但2例患者血清及脑脊液均与转染表达有GABA_AR的HEK293T活细胞呈强阳性反应（图3）。结合2例患者的临床表现、影像学表现及自身抗体检测结果，诊断为抗GABA_AR脑炎。

图3 2例抗γ-氨基丁酸A型受体（GABA_AR）脑炎患者血清及脑脊液中均存在可与HEK293T活细胞表面上表达的膜蛋白GABA_AR结合的自身抗体。患者血清（1∶10稀释）及脑脊液（1∶1稀释）与转染表达有红色荧光标签的GABA_AR（转染亚基为α1、β3和γ2）的HEK293T活细胞孵育。使用绿色荧光Alexa Fluor 488偶联的抗人IgG二抗标记结合的自身抗体，可见2例患者的血清及脑脊液中均存在可结合GABA_AR的自身抗体，呈强阳性反应（A~F：例1，G~L：例2）。自身抗体的结合沿细胞质膜分布。对照脑脊液的反应结果为阴性（M~O）

Figure 3 Live cell-based assay showed two patients′ serum and cerebrospinal fluid (CSF) contained autoantibodies binding to the γ-aminobutyric acid type A receptor (GABA_AR) expressed on the membrane surface of the HEK293T cells. Patients′ serum (dilution 1∶10) and CSF (dilution 1∶1) were incubated with live HEK293T cells expressing α1, β3 and γ2 subunits of GABA_AR (with red fluorescent protein tag). Alexa Fluor 488 conjugated anti-human IgG secondary antibodies were used to label autoantibodies. The results showed these two patients′ serum and CSF robustly bound to GABA_AR expressed in HEK293T cells (A-F: case one, G-L: case two). Note that autoantibodies distributed along with cell membrane. In contrast, CSF from a control individual had no positive reactivity (M-O)

五、治疗及预后

例1入院后初始给予丙戊酸钠、托吡酯、奥卡西平、加巴喷丁口服联合苯巴比妥肌内注射抗癫痫治疗，但患者局灶性发作几乎呈持续发作，且每日均有2~5次全面性发作。加用地西泮持续泵注后患者全面性发作次数减少，但局灶性发作仍无明显改善。入院后第12天在上述抗癫痫药物基础上开始静脉点滴甲泼尼龙，240 mg 1次/d，持续7 d后逐渐减量。至免疫治疗启动后20 d患者在地西泮及苯巴比妥逐渐减停情况下无全面性发作，同时局灶性发作明显缓解，精神症状及意识障碍改善。1个月后患者遗留偶发口角及双上肢抽动，精神明显好转，可独立行走及简单交流。予以带口服激素及抗癫痫药出院。另患者病程中曾出现肺部感染、肝酶升高，经积极抗感染、保肝治疗后好转。出院时改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）评分为3分。出院后患者回当地医院继续康复治疗，激素缓慢减量，至出院后1年患者病情稳定，未再复发，仅遗留轻度记忆障碍及表达能力下降，mRS评分2分。

例2入院后给予500 mg注射用甲泼尼龙琥珀酸钠冲击治疗，并逐渐减量。同时继续予以抗癫痫治疗。此后患者精神症状及记忆障碍较前好转，无再发癫痫，复查头颅MRI病灶范围缩小（图2E，图2F，图2G，图2H）。患者转肿瘤专科进一步治疗肿瘤。出院时mRS评分1分。

讨论

2014年Dalmau团队首次报道了6例临床表现为显著性癫痫伴认知及精神行为异常且影像学表现为颅内多发病灶的患者，其血清和脑脊液中可检测出特异性针对GABA_AR的自身抗体，并命名这种新型的自身免疫性疾病为抗GABA_AR脑炎^[1]。随后，来自英国^[2]、日本^[3]的两个研究组也有少量病例报道。作为一种新近发现的自身免疫性脑炎类型，目前国外报道总病例数不足50例，而国内尚未见报道。根据已有的文献，抗GABA_AR脑炎年龄分布较广，最小年龄为2.5个月，而最大年龄可达88岁，中位年龄为40岁，无明显性别差异^[4,5]。该病常见症状按出现比例由高到低分别为癫痫、认知障碍、行为异常、意识障碍、不自主运动及其他症状^[4]。这些症状均可出现于其他类型自身免疫性脑炎。但需要注意的是癫痫在该病患者中发生的比例及严重程度十分突出^[1,4]。有88%的患者病程中出现癫痫，42%的患者有癫痫持续状态，癫痫的发作形式及部位亦不固定^[4]。部分患者对多种抗癫痫药的治疗反应不佳以至于需麻醉药物中深度镇静治疗^[4]。约40%的患者可合并肿瘤，其中胸腺瘤最常见^[3,4]。除合并肿瘤外，有研究发现在儿童及青少年中抗GABA_AR脑炎可出现于单纯疱疹病毒性脑炎后^[4]，提示病毒性脑炎也可能是该病的潜在诱因。

在影像学表现上，约75%抗GABA_AR脑炎患者头颅MRI表现为皮质及皮质下多发病灶，在T₂-液体衰减反转恢复序列上呈高信号，以颞叶、额叶多见，也可累及顶叶、枕叶及基底节等部位^[1]。这些病灶数量及出现部位可随病程发展而多变，经免疫治疗后可减少甚至消失^[1]。这种影像学表现较其他自身免疫性脑炎具有一定的特征性，对于诊断该病具有提示意义^[4,6]。而该病脑脊液及脑电图表现目前尚未发现有特征性改变^[1,2,4]。

我们报道的2例患者临床表现均有癫痫、记忆障碍及精神异常，头颅MRI表现为皮质及皮质下多发病灶，定位于皮质及边缘系统。患者均为青年男性，亚急性起病，免疫治疗有效，定性诊断考虑免疫性疾病可能性大。2例患者在临床及影像特征上与既往文献报道的病例特征相符。我们通过对患者血清及脑脊液中抗GABA_AR抗体的检测最终使得疾病得到明确诊断。抗GABA_AR脑炎常出现以癫痫为主要表现的皮质受累症状及影像学上的颅内多发病灶。颅内原发肿瘤、转移瘤、淋巴瘤、中枢神经系统脱髓鞘疾病、线粒体脑病、血管炎、颅内感染性疾病等均可有类似表现。抗GABA_AR脑炎的发现为癫痫及颅内多发病变的鉴别诊断增加了新的内容，需引起足够重视。临床上对于出现癫痫，尤其是癫痫持续状态或难治性癫痫合并颅内多发病灶的病例，鉴别诊断应考虑到该病的可能。

抗GABA_AR抗体的检测对于该病的确诊具有关键价值。在拓扑学结构上，GABA_AR通常形成异五聚体离子型受体^[7,8]。该受体由19种亚基编码，包括α1~6、β1~3、γ1~3、δ、ε、θ、π以及ρ1~3^[9]。中枢内常见的组合形式是2个α亚基、2个β亚基及1个γ亚基，形成α-β-α-β-γ排列的五聚体^[8,9,10]。研究发现抗GABA_AR抗体结合的位点主要位于GABA_AR的α1、β3和γ2亚基的胞外端结构域^[1,2,4]。因此，目前用于抗GABA_AR抗体检测的通用检测基质为α1、β3和γ2 3种GABA_AR亚基共转染表达的细胞^[4,11]。我们采取这一策略成功检测出2例患者血清和脑脊液中均存在抗GABA_AR抗体。本研究中2例患者血清及脑脊液中其他常见自身免疫性脑炎抗体及肿瘤神经抗体谱的检测结果均阴性。但值得注意的是，已有文献报道数例抗GABA_AR脑炎患者血清或脑脊液可同时合并有抗N-甲基-D-天冬氨酸受体、抗接触蛋白相关样蛋白2或抗富亮氨酸胶质瘤失活蛋白1抗体^[3,4]，提示有多重自身抗体合并存在的情况。这种现象出现的阳性率及其临床意义仍有待大样本研究以明确。

在治疗上，单纯抗癫痫药往往难以控制癫痫，而免疫治疗及对可能合并肿瘤的切除对抗GABA_AR脑炎有效^[1,4]。该病由于癫痫症状明显，其总体预后较其他自身免疫性脑炎更差。约14%患者可因癫痫持续状态及继发呼吸循环衰竭、感染等死亡，非死亡患者中约有75%后遗神经功能缺损^[4,6]。本组例1无论是在外院还是本院住院期间均有顽固性癫痫发作，多种抗癫痫药物治疗效果欠佳，而加用免疫治疗后症状得以逐步控制。而例2前上纵隔存在占位，活检提示肿瘤性病变，早期使用激素治疗后症状明显缓解。除病灶范围差异外，例1在发病5个月余后启动免疫治疗，其治疗过程较例2更长、更复杂，且病程中因癫痫而行气管切开及辅助通气，同时出现肺部感染、肝酶升高等继发情况。但经过较长时间随访发现患者亦获得良好预后（mRS评分=2分）。而例2在发病初给予抗癫痫药物治疗后癫痫症状缓解，但之后出现记忆下降等新发皮质及边缘系统受累表现。在发病1个月余后患者接受免疫治疗及抗癫痫治疗后病情好转，且颅内病灶减少，提示治疗有效。这些特征提示抗GABA_AR抗体的及时检测、免疫治疗的早期使用及抗癫痫药物应用对改善患者预后十分关键。

GABA_AR主要参与介导中枢神经系统快速抑制性突触电流。抑制性神经递质GABA结合于受体后可使门控通道开放，导致氯离子内流从而降低神经元的兴奋性。因此，GABA_AR结构和功能紊乱是公认的癫痫发生的重要因素^[12]。目前抗GABA_AR抗体的致病机制尚不完全明确。电生理研究表明抗GABA_AR抗体可导致受体介导的抑制性电流减弱^[3]。同时，这些自身抗体可导致神经元表面GABA_AR数量的减少^[1,2,3]，但对GABA_AR的辅助蛋白gephyrin无影响^[1]。这些初步研究结果提示抗GABA_AR抗体可能具有直接的致病性。自身抗体对GABA_AR正常功能的干扰可能与该病的症状，尤其是癫痫具有相关性。但该病自身抗体的产生及致病机制仍有待于进一步的体外及动物模型研究证实。

总之，抗GABA_AR脑炎是一种新型的自身免疫性脑炎。目前国内尚无抗GABA_AR脑炎的报道。脑脊液或血清中抗GABA_AR抗体的检测对该病的确诊具有关键价值。我们利用基于活细胞的间接免疫荧光法成功检测出2例抗GABA_AR抗体阳性的自身免疫性脑炎病例。抗GABA_AR脑炎的突出特征为显著癫痫合并颅内多发病变。认识这些疾病特征，并及早进行相应自身抗体检测对该病的确诊、治疗及患者预后改善十分重要。