肿瘤的表达谱的landscape研究路线

尽管miRNA具有重要的调节功能,它们在肺癌中的作用尚未在基因组层面上进行系统的探索。我们报告了来自109名韩国女性非小细胞肺腺癌（LUAD）患者的肿瘤和正常样本的miRNA和mRNA测序数据的综合分析。对48名患者进行了miRNA测序和RNA测序，为另外61名患者进行了RNA测序数据，随后使用严格标准的差异表达分析产生44种miRNA和2322种基因。使用miRNA-靶信息进行差异表达的miRNA和基因的整合基因集分析揭示了与肿瘤抑制miRNA（TSmiR）靶向的细胞周期相关的几种调节过程。我们在A549和NCI-H460细胞系中进行了集落形成试验，以测试癌症中下调miRNA的肿瘤抑制活性，并鉴定了7种新型TSmiRs（miR-144-5p，miR-218-1-3p，miR-223-3p，miR-27a-5p，miR-30a-3p，miR-30c-2-3p，miR-338-5p），两种miRNA（miR-30a-3p和miR-30c-2-3p）在肿瘤癌基因组图谱（TCGA）LUAD患者队列中显示出不同的存活特征，表明其预后价值。最后，我们确定了可能负责细胞周期调控的miRNA和靶基因的网络簇。研究不仅提供了miRNA的数据集以及来自匹配的肿瘤正常样本的mRNA测序，还报告了几种可能发展成预后生物标记物或治疗性RNA药物的新型TSmiRs。

材料与方法：患者样品来自在韩国首尔三星医疗中心接受治愈性手术的LUAD患者。通过在NanoDrop ND-1000分光光度计上化验总RNA提取物的1来测定RNA纯度。使用RNA完整性数值大于8的Bioanalyzer 2100检查总RNA完整性。然后，使用Illumina Truseq RNA Prep试剂盒v2制备mRNA测序文库。用Sage Science的Pippin制备电泳平台进行cDNA大小选择。用Agilent Bioanalyzer 2100再次验证扩增文库的质量。在HiSeq 2000测序系统上进行合并文库的测序，其中成对末端读数长度为100bp。

用于分析miRNA-Seq和RNA-Seq数据的内部工作流程在图1中示出。对于miRNA-Seq数据，测序读数具有去除的衔接子序列，并使用BOWTIE V.0.12.9映射到miRBase释放，映射率范围为63％至70％。使用R中的分位数归一化方法定量miRNA丰度。使用MAPSPLICE版本v2.1.6和Ensembl GRCh 37.72中的基因模型将mRNA-Seq数据定位至NCBI GRCh 37基因组。用RSEM版本1.2.5在基因水平上估计转录本丰度。表S1总结了映射读数和映射速率的统计数据。

表1.韩国人的患者特征和肿瘤癌基因组图谱队列

 我们利用肿瘤和正常样本的匹配性质（图2）开发了一条严格的管道来识别DEmiRs和基因（DEGs）。EDGER（版本3.16.5），VOOM（limma 3.30.13）和DESEQ2（版本1.14.1）三个不同的程序在初始过滤低表达的miRNA后，用于选择FDR≤的DEmiRs。从三个程序输出中获取常见的miRNA产生142个DEmiRs。通过限定logCPM≥3来进一步滤除低表达的DEmiRs。然后，进一步应用了两个一致性标准（a）肿瘤和正常组织之间上/下调节的方向在超过总患者的80％中是一致的;（b）超过两倍变化的患者数量超过总患者的70％。如图2所示，严格的过滤程序主要保留来自三种算法的通常预测的miRNA。对于mRNA测序数据，我们要求整体平均倍数变化为| logFC |>0.5。一致性标准各自放宽了10％，以允许更多的DEGs，每个步骤的管道和DEG数量如图2所示。

miRNA靶标信息的两个主要来源是miRGator 3.0和最新的TargetScan 7.0。我们的最终编译包括248543个miRNA-靶标关系，涵盖687个miRNA和16563个靶基因。为了选择用于验证实验的肿瘤抑制性DEmiRs的靶基因，考虑四个生物背景（miRNA靶位点的侧翼区域的局部AU含量，30UTR长度，靶位点丰度和热力学配对稳定性）来计算靶mRNA的多元线性回归（MLR）得分。我们选择MLR评分<-0.3的mRNA作为DEmiRs的推定靶标，用于进一步的验证实验。

人肺癌细胞系A549和NCI-H460获自American Type Culture Collection。将细胞维持在37℃，5％环境下，存放于含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI1640中。使用Lipofectamine RNAiMAX以40nm浓度将miRNA模拟物转染至个细胞，到35-mm培养皿中48小时。用miRNA或NC模拟物转染后两天，将500个细胞一式两份地重新铺板在35-mm培养皿中，并在37℃和5％下培养6-8天。将菌落用0.1％考马斯蓝在45％甲醇和10％乙酸溶液中染色，并使用Gel Doc XR系统中Quantity One 1-D分析测定菌落数。每个实验一式三份进行。

使用miRNeasy Mini试剂盒从miRNA模拟转染的细胞中提取所有RNA。使用ImProm-IITM逆转录酶从1μg总RNA中合成单链cDNAs。对于miRNA-靶mRNA水平的定量分析，使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）中SYBR Select Master Mix（Life Technologies的Life Biosystems）对从总RNA的10ng产生的cDNA进行PCR扩增，ACTB和HPRT1用作双重参考基因。循环条件如下：在95℃下预变性2分钟，在95℃下进行2步反应（40个循环）10秒，在60℃下进行40秒，并进行解离峰分析。用Bio-Rad CFX Manager软件计算靶基因的mRNA表达值。

结果：匹配的肿瘤-正常样品获自109名接受过根治性手术的LUAD患者。所有病例均为女性首次肺癌患者。除8名吸烟者外，大多数患者从不吸烟。对来自48个个体的匹配的肿瘤正常样品进行了miRNA-Seq和mRNA-Seq。对于剩余的61个个体，仅产生匹配的肿瘤-正常样品的mRNA-Seq数据。从TCGA LUAD下载了miRNA-Seq数据，其中包括来自两个匹配的肿瘤-正常样本的测序数据的39个病例。通过匹配的肿瘤-正常样本能够获得DEmiR和mRNA（DEG）列表。MA图显示平均倍数变化与这些DEmiRs的平均表达水平（图1A）。热图和多维缩放视图表明肿瘤和正常样本根据这44个DEmiRs的表达完全分为两组（图1B，C）。来自39名TCGA LUAD患者的miRNA-Seq数据的相同分析产生47个DEmiRs（19个上调和28个下调），其中25个与ES_Korea DEmiR重叠。在框图（图2和图3）中描绘了DEmiR在肿瘤和正常组织中的表达。使用管道分析来自ES_Korea病例的miRNA-Seq数据，获得了44个高度可靠的DEmiR，包括18个肿瘤中的18个上调和26个下调的miRNA。来自39名TCGA LUAD患者的miRNA-Seq数据的相同分析产生47个DEmiRs（19个上调和28个下调），其中25个与ES_Korea 的DEmiRs重叠。我们观察到除了少数病例之外，大多数miRNA在ES_Korea和TCGA LUAD数据集之间一致地差异调节。对配对的RNA-Seq数据进行DEGs的计算管道，我们获得了2322个DEG作为最终结果（935个上调，1387个下调基因）。使用50个标志基因组MSigDB对935个上调和1387个下调的DEG进行功能富集分析，显示了24个标志性特征(图3)。

 图1  48名韩国LUAD患者的miRNA表达

（A）日志倍数变化（log2 exp_tumor / exp_normal）和平均表达式（½log2exp_tumor*exp_normal）的MA图分别显示在y轴和x轴上。在该图中使用超过48个个体的平均miRNA表达值。DEmiRs以红色（肿瘤上调）和蓝色（肿瘤下调）颜色显示。

（B）通过多维缩放方法获得的二维空间中的肿瘤和正常样品的表示。

（C）使用44个DEmiR对样本进行分层聚类。

 图2 表达框图显示在ES_Korea群组的肿瘤样品中下调的26种miRNA。肿瘤和正常样品分别以红色和蓝色表示。在右侧显示了TCGA群组中的miRNA表达（具有匹配的肿瘤的正常样本的39名患者）用于比较。中间的热图显示了log10（q值）中差分表达式的FDR测试的q值。注意，在图S3中提供了肿瘤样品中上调的miRNA的箱形图

 图3 来自MSigDB和相关miRNA的标志特征的功能丰富术语。左边的热图表示DEGs浓度的q值（q值），其中肿瘤样品中的上调和下调分别以红色和蓝色显示。使用所有DEGs（935 up和1387下调DEG）计算第一和第三列，并且通过使用作为DEmiRs靶标的DEG子集（452上调和562下调DEG）获得第二和第四列。右侧的黑色和白色热图表明，对于每个过程，存在或不存在针对DEG的miRNA，其中验证和预测的目标分别以黑色和灰色显示。

 miRNAs的分子和细胞功能通常通过其靶mRNAs的功能推断，我们寻找满足条件的miRNA和靶基因对（a）其中miRNA和靶基因都被差异调节，（b）其差异表达方向彼此相反，（c）通过合并编译的miRNA靶向相关联miRGator 3.0中的内容和最新的TargetScan 7.0预测。我们鉴定了1948个DEmiR-DEG配对关系，涵盖了44个DEmiRs（分别在肿瘤中上调和下调22和22）和1014个DEGs（分别在肿瘤中上调和下调452和562）。这种DEmiR-DEG对很有可能在LUAD的病理生理学中起作用。

我们使用MSigDB标志基因组对由DEmiRs调节的1014个目标DEG进行基因组分析。miRNA-target DEGs的丰富生物学过程包括激活途径的G2M_检查点和E2F_靶标以及抑制过程的TNFαSignaling_via_NFjB和Inflammatory_response。使用我们的miRNA-靶标信息汇编和最近更新的miRTarBase 7.0知识库（图3），研究在每个富集过程中靶向基因的DEmiR。我们从文献调查中确定了几种已知针对特定过程的miRNA。例如，已知miR-138-5p和miR-144-3p靶向EZH2基因，miR-30a-5p靶向MYBL基因以调节G2M_checkpoint和E2F_target过程。然而，许多过程没有文献基础来鉴定调节miRNA及其靶标，包括p53_途径，糖酵解，雌激素反应，KRAS信号传导，TNFα信号传导，炎症反应和IL2_ STAT5信号传导。因此，我们的分析为进一步的功能研究提供了充分的可能性。

进行菌落形成测定以筛选具有生长抑制能力的miRNA。我们基于倍数变化率（logFC <-2），平均表达水平（logCPM> 10）和文献证据，从ES_Korea数据集中主观地从26个下调的DEmiR中选择了14个候选miRNA。使用A549和NCI-H460人肺癌细胞系的集落形成测定揭示了七种新的TSmiR（miR-338-5p，miR-30a-5p，miR-30c-2-3p，miR-144-5p，miR-27a-5p，miR-223-3p，miR-218-1-3p），除了用作阳性对照的miR-486-5p外，在两种细胞系中都具有肿瘤抑制活性（图4A）。由于从数据集中选择DEmiRs的严格程度，14位候选人中有8位成功率很高。

使用为TCGA患者提供在线生存分析的OncoLnc（分析了490个LUAD病例），我们发现两个miRNA，miR-30a-3p和miR-30c-2-3p的存活曲线，显示miRNA表达中顶部和底部10百分位的患者组之间有意义的分离（图4B,C）。此外，作为miR-30c-2-3p的预测靶基因之一的SERPINH1在顶部和底部20百分位的患者组之间显示出明显的分离（图4D）。这些数据有力地表明miR-30c-2-3p可能是具有LUAD预后价值的TSmiR。

 图4 TSmiR候选物的功能和存活特征

（A）在A549（上）和NCI-H460（下）细胞系的集落形成测定中相对于阴性对照的菌落数。 误差条表示平均值的标准误差。每次测量一式三份进行，并且用双尾t检验计算P值。

（B-D）通过miR-30a-3p（B），miR-30c-2-3p（C），SERPINH1（D）和miR-30c-2-3p的靶基因的表达值使用TCGA LUAD患者的Kaplan-Meier存活图。

为了鉴定其活性从集落形成测定验证的TSmiR的靶基因，我们进行定量RT-PCR以定量由转染的miRNA模拟物引起的mRNA表达变化。对于5种miRNA（miR-30c-2-3p，miR-144-5p，miR-486-5p，miR-27a-5p，miR-218-1-3p）显著降低两种肺癌细胞的集落形成能力，我们使用最先进的算法选择42个候选靶基因来预测miRNA靶基因。我们鉴定了17种靶基因，其与miRNA模拟物转染相比，在两种细胞系中与对照样品相比显示出降低的mRNA表达降低了30％以上（图5）。SERPINH1基因是miR-30c-2-3p的有效靶标之一，再次表明其致癌功能与miR-30c-2-3p的肿瘤抑制作用一致。从MSigDB富集分析推断出，几种靶基因（E2F8，MYBL2，HMGB3和TOP2A）属于E2F_Targets和G2M_Checkpoint的基因组。我们通过收集miRNA及其靶基因构建了一个调节细胞周期的网络模型，并通过实验验证（图6）。因为所有miRNAs和基因在肿瘤和正常组织之间差异调节，该网络模块极有可能在肺癌的肿瘤发生中起作用。

 图5 当在A549（上图）和NCI-H460（下图）细胞系中用miRNA模拟物转染细胞时，qRT-PCR实验中靶基因表达的相对变化。每次测量一式三份进行，并且用双尾t检验计算P值。

 图6 调节细胞周期的网络模型。所有miRNA及其靶基因在肿瘤和正常样品之间以一致方向差异表达，具有miRNA的负调节。

我们的研究报告了来自49个肿瘤正常配对LUAD样本的miRNA和mRNA的高通量测序数据的综合分析。我们进一步鉴定并实验验证了7种新的TSmiR，其中两种（miR-30a-3p和miR-30c-2-3p）显示了预后分子标记的优点以及治疗性操作的潜在靶标。使用适当的对照样品进行多层深度测序，然后进行深入的整合分析，证明是描述癌症病因学背后的分子机制以及鉴定预后价值的分子生物标志物的有效方法。