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荜茇酰胺（Piperlongumine，PLG) 是传统中草药荜茇的一种生物碱单体成分，其具有较好的抗炎、抗氧化作用，且PLG已经证实可以在鱼藤酮、6-OHDA、 MPTP等多种 PD 模型中起到神经保护作用。 首都医科大学基础医学院杨慧教授课题组发现鱼藤酮处理造成线粒体损伤及细胞凋亡，而 PLG 治疗后可以通过激活MAPK8信号通路，从而促进抗凋亡蛋白Bcl-2 磷酸化，后者一方面通过促进其与促凋亡蛋白Bax发生相互作用抑制细胞凋亡，另一方面通过与 Beclin1 发生解离而激活自噬，进而清除受损线粒体，间接抑制细胞凋亡，最终通过调节自噬、凋亡再平衡而发挥神经保护作用（图1）。 图1. PLG通过促进BCL2磷酸化恢复细胞凋亡和自噬之间的平衡。 这一重要成果以“Piperlongumine restores the balance of autophagy and apoptosis by increasing BCL2 phosphorylation in rotenone-induced Parkinson disease models”为题发表于Autophagy（21 Feb 2018；自噬领域TOP期刊，2018年IF = 11.100）。 研究思路与方法课题组首先发现，PLG可以缓解鱼藤酮诱导的PD动物模型中脑黑质多巴胺能神经元缺失以及运动行为学障碍，且线粒体可能为 PLG 的干预靶点（图2）。 图2.PLG对鱼藤酮动物模型的神经保护作用。 随后，发现PLG可以缓解鱼藤酮诱导的 Complex I 活力下降， mPTP 的开放，进而稳定线粒体膜电势而发挥细胞保护作用（图3）。 图3. PLG缓解鱼藤酮诱导的线粒体损伤。 上述结果初步表明PLG通过保护线粒体功能而缓解鱼藤酮诱导的细胞损伤。 第二步，课题组使用鱼藤酮和 PLG 处理各组细胞后，通过 western blots 的方法对各组细胞裂解液中自噬标志物 LC3-I 向 LC3-II 的转化情况和自噬底物 p62（SQSTM1） 的蛋白水平进行了检测，结果发现PLG 治疗组中自噬标志物 LC3-II 水平显著增加， 而自噬底物 p62 水平有所降低，提示 PLG 与鱼藤酮共处理的情况下可以激活细胞内自噬水平（图4）。 图4.PLG诱导鱼藤酮细胞模型内自噬的发生。 此外，课题组通过mRFP-GFP-tagged LC3-expressing virus（吉凯基因构建）感染SK-N-SH细胞和原代神经元细胞以观察自噬小体生成状况，并通过 Mito Tracker red 标记线粒体， 以观察了二者的共定位情况。结果显示，在鱼藤酮与 PLG 共处理组中，出现了明显的 LC3的绿色荧光点状聚集体，并且这些绿色荧光聚集体可以与 Mito Tracker 标记的红色线粒体发生共定位，提示在该处理组中存在线粒体和自噬小体的共定位，即自噬可能参与了线粒体的降解（图5）。 图5. PLG激活自噬有助于受损线粒体的清除。 第三步，课题组接下来使用免疫共沉淀的方法探究 PLG 对自噬的诱导作用是否是通过影响了Bcl-2-Beclin1 的相互作用情况。结果显示，与鱼藤酮组细胞相比， PLG 治疗组 Bcl-2-Beclin1 的相互作用水平明显降低，提示 PLG 处理可能通过促进了二者的解离而发挥了自噬激活作用。而抑制 Bcl-2 可以使 PLG 失去了对 Bcl-2-Beclin1 的解离作用，进一步提示了 Bcl-2 可能是 PLG 的作用靶点。此外，在 PLG 与鱼藤酮共处理组中， Bcl-2 ser70 位点的磷酸化水平较鱼藤酮模型组显著增加，提示 PLG 处理促进了 Bcl-2 ser70 位点发生磷酸化。以上结果提示，PLG 可能通过作用于Bcl-2 ser70 位点，促进Bcl-2-Beclin1 发生解离，从而诱导自噬的发生。 第四步，课题组进一步检测了Bcl-2-Bax 的相互作用情况，以评估 PLG 是否可以通过影响 Bcl-2-Bax 异源二聚体的形成而调节细胞凋亡。结果显示，与鱼藤酮组细胞相比， PLG 治疗组中 Bcl-2-Bax 的相互作用水平增加，后者可以直接抑制细胞凋亡。综上提示， PLG 处理可以通过增加 Bcl-2 ser70 位点的磷酸化水平，稳定 Bcl-2-Bax 异源二聚体，从而抵抗细胞凋亡。 第五步，最后，课题组检测了 Bcl-2 上游蛋白 MAPK8的激活情况，其激活可以通过磷酸化水平表征。结果显示，与鱼藤酮组细胞相比， PLG 治疗组 p- MAPK8 水平显著增加， 且这与 Bcl-2 磷酸化水平增加的结果相一致，提示 PLG 是通过激活了 MAPK8信号通路，从而促进了 Bcl-2 ser70 位点的磷酸化。此外，以上结果均在动物实验上也得到了验证，即 PLG 治疗后，可以通过激活 MAPK8信号通路而增加 Bcl-2 ser70 位点的磷酸化水平，后者一方面促进 Bcl-2-beclin1 发生解离从而激活自噬，另一方面稳定 Bcl-2-Bax 异源二聚体，从而抵抗细胞凋亡。 研究结论PLG可以减轻鱼藤酮诱导的PD动物模型中的运动损伤和中脑多巴胺能神经元的损失，还改善了由鱼藤酮引起的细胞活力下降，抑制细胞毒性。这些保护作用通过激活MAPK8通路增加Bcl2 Ser70位点的磷酸化来抑制细胞凋亡和诱导自噬。这一发现表明靶向Bcl2恢复细胞凋亡和自噬之间的平衡可能是PD的有效治疗方法。 |
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