肿瘤代谢：文章和基金的最爱，一文了解实验步骤

九色枫林 2019-05-30

展开全文

近年来肿瘤代谢相关研究越发火热，高分文章不断涌现，国自然中标基金数目也逐年增加。而且其他肿瘤学热点研究领域中也发现肿瘤代谢关键酶的异常表达以及相关代谢产物的异常积累与肿瘤免疫，肿瘤干细胞，肿瘤细胞的表观遗传修饰密切相关。

pubmed中的“Tumor energy metabolism ”的文章发表量

2018国自然基金中细胞能量代谢的基金数在50个左右

本系列将以几个篇幅详细介绍一下肿瘤代谢的基本概念、研究思路、实验方法和论文套路。

肿瘤糖代谢

早在1924年Warburg发现，肿瘤细胞和正常细胞有着不一样的糖代谢模式。除了有氧状态下葡萄糖的摄取速率更高之外，即使在氧浓度正常的条件下，肿瘤细胞仍然倾向于无氧酵解，并能将代谢的乳酸分泌出细胞外，防止底物堆积。显然，这种有氧糖酵解（aerobic glycolysis）的用氧模式，能让肿瘤细胞在大量分裂增殖时候游刃有余，毫无压力。Warburg因此获得1931年的诺奖。

目前，“Warburg效应”作为肿瘤的一个典型标志已被广泛认可。2011年，Robert A.Weinberg教授在Cell杂志发表综述，将肿瘤异常的代谢表型列入肿瘤十大特征之一。人们几乎在所有肿瘤中都证实了Warburg效应的存在。同时近年来的研究中也发现其他诸多代谢通路包括脂肪酸代谢、胆固醇代谢、谷氨酰胺代谢、丝氨酸代谢、一碳单位代谢、胆碱代谢等，在肿瘤细胞中均发生了重编程变化。但是糖代谢的异常是肿瘤代谢中最为常见和基础的研究类型。

研究思路

肿瘤代谢研究中的靶点主要着眼于以下两方面

第一是代谢过程中关键酶，研究其转录水平调节，转录后修饰，最终导致酶表达量的变化以及活性的变化。例如：HIF-1α是Warburg效应的关键调控因子，通过与糖酵解基因启动子上的缺氧反应元件（hypoxia-responsive elements, HRE）结合来促进糖酵解相关酶的表达。c-Myc能够直接转录激活编码葡萄糖转运体1 (GLUT1)和乳酸脱氢酶 (LDHA) 的糖酵解基因，并促进异常糖酵解。p53肿瘤抑制因子通过直接抑制GLUT1和GLUT4基因的转录，从而抑制葡萄搪摄取和乳酸产量。在这些经典的转录因子外寻找其他的诸如诸如非编码RNA，表观遗传修饰等调节是最近研究的趋势和热点。

第二是代谢异常导致的中间产物的积累，进而影响表观遗传修饰，药物抗性等其他肿瘤生理过程。如最近的研究发现肿瘤细胞中甲硫氨酸需求量增加导致其甲基化修饰上调进而上调肿瘤干细胞成瘤性。

这两种研究套路类型我们将在本系列后续两篇文章中分别举例介绍。

研究方法与实验技术

肿瘤代谢研究中也需要用到一些特有的实验方法。如在肿瘤的氧化糖酵解研究中，氧耗率（OCR），和酸化率（ECAR）常被用于衡量氧化磷酸化和糖酵解的强度。其具体实验步骤如下：

通过加入药物寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素A处理并测定不同时间点的OCR值，反映细胞的氧化磷酸化水平。通过检测加入葡萄糖，寡霉素，2-DG后的反应，测定不同时间点的产酸率，确定细胞糖酵解速率的变化。

（A）96孔生物能量分析仪细胞培养微型板中单层细胞的铺备：将配制好的细胞悬液利用血细胞计数板进行细胞计数，确定细胞密度;取适量体积细胞悬液至1.5 mL EP管中，计算所需细胞数总量，补充培养基（DMEM + 10％FBS）至800μL;将细胞重新吹匀打散后种于细胞培养板中，每孔80μL，同时在背景校正孔中加入80μL培养基（DMEM + 10％FBS）;将细胞放入37°C，5％CO2细胞培养箱中培养过夜。

（B）测量探针板的孵化：向探针板的每个孔加入140μLpH7.4的校正液，随后培养过夜（37度，无CO2）过夜（将探针用保鲜膜包住，以免校正液蒸发过多）。

（C）在显微镜下检查96孔板中单层细胞的生长情况，确保细胞生长状态良好。将96孔板中原有的80μL培养基（DMEM + 10％FBS）吸出，向每孔中加入120μL已温浴至37°C的培养基，轻轻摇动96孔细胞板，将培养基吸出，再向每孔中加入175μL的分析培养基（上述操作要极为小心谨慎，以免细胞脱离培养板底部）。随后将96培养板放入到PS装置中（37°C，无CO2），约1小时。

（D）测量探针板中工作液的加入：将事先配制好的浓度分别为8,9,10,10μmol/ L的寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素A工作液，按25μL/孔加入到相对应的A，B，C孔中，使这4种药物的最终浓度均为1μmol/ L（药物的最终工作浓度需要根据细胞的不同而进行优化）。

（E）程序的运行：根据公司提供的说明书设置程序进行预实验，若无文献报道则需进行摸索条件的细胞或药物可根据说明书给出的建议进行程序的设置），运行实验。导出数据，进行统计分析。