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神经浸润（PNI）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的关键病理特征，可预测生存率低下,相关的临床特征仍然不确定，分子机制在很大程度上是未知的。从TCGA下载HNSCC基因表达和相应的临床数据，用逻辑回归评估潜在的PNI风险因子。用加权基因共表达网络分析WGCNA鉴定PNI相关基因共表达模块，单细胞转录组数据集GSE103322评估关键模块基因功能和PNI中非恶性细胞的作用。PNI与总生存率显著负相关，年龄，性别，吸烟史和酒精史不是风险因素，HPV阳性病例发生PNI的可能性低于HPV阴性病例，WGCNA鉴定了独特的显著PNI相关共表达模块。单细胞转录组数据分析显示，PNI相关模块中的基因与特征“EMT”，“转移”和“侵袭”相关。在非恶性细胞中，成纤维细胞具有相对高的关键基因表达。在分子和原子水平上，证实了HNSCC中的PNI是一个入侵过程而不是简单扩散过程，成纤维细胞可能在PNI中起重要作用。 1.数据采集 从TCGA下载基于每千万分之一片段（FPKM）的基因表达数据500例和相应的HNSCC临床信息528例。在数据中，370例患者的数据可用PNI状态用于评估PNI的风险因素，使用具有可用PNI状态和存活结果的319名患者的数据来分析PNI对预后的影响。来自351名患有基因表达数据和PNI状态数据的患者的数据用于WGCNA，基因集富集分析和差异表达分析。 2.预后分析 使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验进行存活分析，用R软件和“survminer”R包的Cox比例风险模型计算危险比。 3.风险因素评估 使用逻辑回归模型检验年龄，性别，烟草史，人乳头瘤病毒HPV和其他潜在风险因素与PNI发病率的关联估计优势比OR和95％置信区间CI。WGCNA通过方差分析6,249个基因，确定的最多变异基因的前25％被选择用于WGCNA，WGCNA R包用于构建基因共表达网络。估计软阈值为5并用于使用拓扑重叠测量TOM导出所选基因的成对距离矩阵，TOM能够量化网络邻居的程度。使用平均连锁层次聚类来对具有相似表达谱的基因进行分类，进入相同的基因模块。ME总结了该模块的特征表达模式，计算ME以评估模块和临床特征PNI状之间的相关性。MM是给定基因的表达水平与给定ME之间的Pearson相关性，在重要模块中具有最高MM的前12个基因被认为中枢基因，使用Cytoscape 3.6.1表示目标模块中的基因共表达网络，对构建的网络进行可视化分析。 4.基因本体论GO生物过程 从Gene Expression Omnibus数据库下载GSE103322数据集中的基因表达谱，单细胞数据集包含来自18位患有口腔肿瘤的患者的5,902个单细胞，用收集了14个功能状态签名的癌症单细胞数据库探索靶基因模块中基因的功能。使用基因集变异分析GSVA和Spearman等级相关性来计算GSE103322中2,105个单个癌细胞的14种功能状态的活性以及活性和基因表达之间的相关性。 5.差异表达分析 R包“limma”用于筛选具有PNI和无PNI的病例之间差异表达的基因，建造火山地块以显示DEG。 6.GSEA 根据PNI的存在与否，将共351个HNSCC样品分成两组，p<><> 结果：在生存分析中包括的319名患者中，发现PNI存在于144名患者中，生存分析显示PNI与总生存期OS呈显著负相关。对OS进行了探索性亚组分析（图1,2），发现PNI与晚期患者OS病变显著相关，而早期患者的OS不受PNI的影响。对于病理性T1-2类别，PNI与OS无显著相关性，PNI降低了T3-T4病变患者的OS。对于N2-N3类别的患者，PNI的OS恶化趋势明显，N0-1患者PNI的存活率下降更为显著。为了比较PNI与其他临床变量对预后的影响，进行了单变量和多变量Cox回归分析。在单变量分析中，年龄，结外延伸ENE，PNI，病理学发现T类和病理N类是预后因素。使用PNI和其他临床变量构建了预测HNSCC预后的列线图。 年龄，性别，吸烟史和酒精史不是PNI的危险因素，患者淋巴管浸润比没有这些因素更可能发展PNI，T类较高或N类的患者存在风险PNI，HPV阳性患者比HPV阴性患者发生PNI的可能性更小，口腔舌癌似乎可能发展为PNI，而其他区域，如扁桃体或舌根的PNI发生率相对较低（图3C）。 图1 （A，B）PNI患者和无PNI患者OS的亚组分析 （C）有和没有PNI的患者的OS 图2 比较（A）吸烟史（B）酒精史（C）HPV状态（D）种族（E）病理性T类别和（F）病理性N类别的患有和未患有PNI的患者的OS率。 图3 （A）PNI相对于年龄，性别，吸烟史，酒精史，HPV状态，LVI，ENE，边缘状态，肿瘤组织学分级，病理T类，病理N类和病理分期的相对风险。 （B） PNI与LVI，ENE，HPV状态和病理分期关系的回归曲线。 （C） PNI与原发肿瘤的解剖分布之间的关系。 HPV，人乳头瘤病毒; LVI，淋巴血管侵犯; ENE，结外延长。 在聚类后移除TCGA中的26个异常样品，剩余的325个样品（图4A），样本间差异最大的6,249个变异基因通过平均连锁分层聚类分组为模块。选择β= 5的值作为软阈值以确保无标度网络，共鉴定了19个模块，未分配的基因被分类为灰色模块（图4B）。PNI和共表达网络之间的关系如图5A，B所示。褐色模块与PNI显著相关，使用热图可视化TOM描绘邻接或拓扑重叠（图5D）。棕色模块中具有最高MM的前12个基因TIMP2，MIR198，LAMA4，FAM198B，MIR4649，COL5A1，COL1A2，OLFML2B，MMP2，FBN1，ADAM12和PDGFRB被认为中枢基因。棕色模块的加权共表达网络显示在图6A，B中。 GO分析结果显示，基因主要在BP类别中富集细胞外基质ECM组织，胶原分解代谢过程，细胞粘附，胶原纤维组织，ECM解体，血管生成，内皮细胞迁移和伤口愈合（图6C）。棕色模块中的基因富集在CC类别的ECM区域中（图6D）。对于MF类，基因富含ECM结构成分，胶原结合，整联蛋白结合，钙离子结合，ECM结合，血小板衍生生长因子结合和胰岛素样生长因子结合（图6E）。KEGG通路分析结果显示，这些基因主要参与ECM受体相互作用，粘着斑，PI3K-Akt信号通路，蛋白质消化和吸收，溶酶体，癌症中的蛋白聚糖，肌动蛋白细胞骨架的调节和间隙连接（图6F）。 在CancerSEA数据库收集的14个功能状态特征中，发现2,105个癌细胞中褐色模块基因的表达与“EMT”，“转移”和“侵袭”特征呈正相关。关键模块基因的表达与“干性”之间呈负相关（图7A和7C），与其他功能状态特征的相关性如图7B所示。 分析GSE103322数据集中基因的分布，其中包含5,902个单细胞的表达谱，结果以热图的形式显示（图8），进一步评估中枢基因TIMP2，MIR198，LAMA4，FAM198B，MIR4649，COL5A1，COL1A2，OLFML2B，MMP2，FBN1，ADAM12和PDGFRB的分布。在不同细胞类型中，大多数中枢基因TIMP2，MIR4649，COL5A1，COL1A2，OLFML2B，MMP2，FBN1和PDGFRB的表达在成纤维细胞中最高。MIR198，LAMA4，FAM198B和ADAM12的表达在成纤维细胞中也相对较高，hub基因的表达水平在内皮细胞和巨噬细胞中相对较高（图9）。在TCGA中使用和不使用PNI的病例之间进行了GSEA。在FDR <0.05和| log="" 2倍变化|=""> 1的阈值下，鉴定出总共161个DEG，92个上调，在TCGA中的PNI样品中下调69个。 图4 （A）去除异常值后的HNSCC表达数据的聚类分析。 （B）聚类基因的树状图。层次聚类分析树形图用于检测共表达聚类，每种颜色分配给1个模块（灰色代表未分配的基因）。 图5 （A）模块之间的相互关系。 （B）不同模块-PNI关系的相关值。 （C）棕色模块中与PNI相关的基因MM与PNI的基因显着性之间的相关性的散点图。 （D）网络热图图，显示由聚类树分类成行和列的基因。 较浅的颜色表示较低的邻接，较暗的颜色表示较高的邻接。 图6（A）关键模块中共表达网络的可视化表示。 （B）当考虑由WGCNA计算的仅超过0.2的权重时的共表达网络。中心基因突出显示。 （C-F）棕色模块基因的GO和途径富集分析。 （C）BP分析 （D）CC分析 （E）MF分析 （F）KEGG途径分析 图7 （A）热图显示了来自GSE103322数据集中2,105个单个癌细胞的分析的关键模块基因的表达与功能状态特征之间的相关性。MEE5，MEE6，MEE7，MEE10，MEE12，MEE13，MEE16，MEE17，MEE18，MEE20，MEE22，MEE24，MEE25，MEE26和MEE28代表来自不同患者的细胞。 （B）基因表达与14种功能状态之间相关性的热图。 （C）褐色模块基因表达与“EMT”，“转移”，“侵袭”和“干性”之间的关系的细节。 图8 在5,902个恶性和非恶性单细胞中关键共表达模块中所有357个基因的表达水平。 图9 在5,902个恶性和非恶性单细胞中中枢基因（A）TIMP2，（B）MIR198，（C）LAMA4，（D）FAM198B，（E）MIR4649，（F）COL5A1，（G）COL1A2，（H）OLFML2B，（I）MMP2，（J）FBN1，（K）ADAM12和（L）PDGFRB的表达水平 PNI与生存率低有关，尤其是晚期HNSCC患者，HPV阴性HNSCC病例比HPV阳性病例更可能发展为PNI。通过分析TCGA的数据，确定了一个PNI相关的共表达模块，该模块由在ECM重塑，胶原分解代谢过程和细胞粘附等过程中起作用的基因组成。在对单细胞转录组数据的分析中，发现癌细胞中PNI相关模块中基因的表达与功能状态“EMT”，“转移”和“侵袭”相关，证实了HNSCC中的PNI是一个入侵过程而不是简单扩散过程。
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