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孙子兵法有云：知己知彼，方能百战不殆。军事纷争如是，与肺癌斗阵亦如是。 为了探索中国人群肺腺癌及肺鳞癌的基因谱及免疫浸润情况，广东省人民医院&广东省肺癌研究所张绪超（第一作者）、吴一龙教授（通讯作者）牵头开展了CHOICE研究。该研究收集了245名（131例腺癌，114例鳞癌）初治的肺癌患者的肿瘤、癌旁组织和血液样本。采用全基因组拷贝数生物芯片技术、全外显子组和转录组二代测序技术、融合基因检测及双重免疫组织化学染色等方法检测及分析这些肺癌患者的基因谱和免疫学特征，结果与TCGA基因数据库（数据主要来源西方人群）进行比对，深度挖掘中国肺腺癌、肺鳞癌患者的免疫基因组特征，为这些患者的靶向治疗及免疫治疗策略制定提供依据。 1. 基因组特征： 体细胞CNVs变异： 综合来看，CHOICE 研究中拷贝数变异（CNVs）谱和TCGA中的结果基本一致。CHOICE研究中不同肺癌亚型的CNVs谱不同。该研究发现这些患者中存在较高水平的1q，2p, 3q, 5p, chr7和8q的扩增以及3p, chr4, 5q, 8p, 9p, 13p和17p的缺失。肺鳞癌中2p, 3q的扩增和3p, chr4, 5q和13q的缺失较肺腺癌常见, 1q和chr2的扩增在吸烟患者中更常见。 图注：肺腺癌与肺鳞癌的CNVs谱。1-22，X，Y为染色体编号 在CHOICE研究中新发现了部分有义扩增突变和缺失突变。15q11.2在肺鳞癌和肺腺癌中均出现扩增，而8p23.1在肺腺癌中表现为扩增突变但在肺鳞癌中表现为缺失突变。更有趣的是，肺腺癌中的14q11.2（含有OR4K5，OR4K1，TRA，TRD和CCNB1IP1）均观察到扩增和缺失突变，提示该区域的染色体结构高度可变。 对比TCGA和CHOICE研究数据发现，在肺鳞癌中，扩增频率较高的热点基因的是SOX2，WHSC1L1-FGFR1，CCND1和MYC。而缺失频率较高的热点基因的是CDKN2A，ERBB4，FAT1，PTPRD和CSMD1。在肺腺癌中，扩增频率较高的热点基因是NKX2-1，TERT，MDM2和MCL1基因，缺失频率较高的热点基因是CDKN2A和15q11.2（其上含有POTEB，NF1P2，SYK，RPL5和PIK3R1）。
基因突变、肿瘤负荷及融合基因检测： 肺腺癌中，TP53，EGFR和KRAS较常见；而在肺鳞癌中TP53，KEAP1，NFE2L2和KRTAP4-7较常见。与TCGA（TCGA cohort 2014）相比，CHOICE队列中肺腺癌患者EGFR突变频率较高，而KRAS和BRAF突变频率明显较低；STK11，PIK3CA和ARID1A在两个研究队列之间突变率一致。在非吸烟者中，女性肺腺癌的EGFR突变率较高。与TCGA(TCGA cohort 2016)相比, 肺鳞癌中RB1和FBXW7突变频率较高，PIK3CA突变频率较低；肺腺癌中IQSEC2和肺鳞癌PABPC3的突变频率更高。
该研究在肺腺癌及肺鳞癌患者中检测到的TMB（肿瘤突变负荷）分别为8.0和11.8。在肺腺癌患者中，吸烟者的TMB高于非吸烟者。EGFR突变或ALK融合的肺腺癌患者TMB显著降低。CHOICE研究中，与非吸烟者相比，吸烟患者中存在着较多的C> A碱基颠换。 图注：不同类型患者中的TMB 图注：吸烟患者与非吸烟患者的碱基突变类型分布 该研究在肺腺癌中检测到了常见融合基因如：ALK-EML4（n=6）、CCDC6-RET (n=1), CD74-ROS1 (n=1), KIF5B-RET (n=1), 在肺鳞癌中检测到了FGFR3-TACC3 (n=1)。同时也检测到了新的融合基因如CLTC-VMP1 和PPFIBP1-STK38L。 肿瘤浸润淋巴细胞富集谱分析： 通过ssGESA进行基因富集分析发现，肺腺癌中的TILs明显比鳞癌中丰富（72.5% vs.54.4%）。全部人群中，存在着较丰富的B细胞浸润，而效应T细胞、NK细胞及Treg细胞较少。肺腺癌中的抗原递呈细胞（APM）及Th1细胞比例较肺鳞癌高（APM:45% vs.20%; Th1:18% vs. 7%）。在吸烟患者与非吸烟患者中都观察到了较丰富的TILs和APM（吸烟患者: 70.2%; 非吸烟患者: 76.6%）。在吸烟患者的肿瘤微环境（TME）中观察到更多的Th1, Th2和巨噬细胞浸润，提示吸烟患者的炎症反应更强；非吸烟患者的TME中B细胞及树突状细胞更多。 图注：肺腺癌与肺鳞癌中的TILs等丰度 2.免疫特征： 基因突变与免疫浸润的关系： 通过ssGESA发现的26个免疫细胞类型的基因标签，采用 “去卷积”分析方法，建立了微环境的免疫分子标签。计算每个患者的免疫标签得分，分成高分（HIGH）、低分（LOW）及介于两者之间（MIX）的评分3种免疫类型。评分HIGH的患者无论是肺腺癌还是肺鳞癌都有着比较高的免疫相关基因（IFNG，PD-L1，PD-1和CD8）的高表达，但是三种免疫类型之间的突变负荷没有明显的统计学差异。
在肺腺癌中，评分HIGH的患者，KRAS突变及扩增的比例较高；评分MIX及LOW的患者，EGFR突变的比例较高；在STK11突变的患者的PD1、PD-L1及T细胞相关标志物降低，中性粒细胞相关标志物升高，但是两者之间仅有T细胞相关标志物具有明显统计学差异（p=0.01）。 图注：肺腺癌患者STK11基因突变与其免疫相关标志物的分布 在肺鳞癌中，则显示出了不同的特征：评分MIX及LOW的患者，TP63、PIK3CA和SOX2扩增及TP53、NFE2L2突变较多，同时显示出较多的PTEN缺失及PIK3CA的扩增。在PIK3CA扩增或者PTEN缺失较多的肺鳞癌患者样本中，T细胞相关标志物及CD8的表达明显减少。
图注：a:肺腺癌中不同免疫评分类型中的驱动基因谱 b:肺鳞癌中不同免疫评分类型中的驱动基因谱 对这些患者的RNA表达谱进行对比分析发现，肺腺癌中免疫相关通路活化较多；肺鳞癌中则以经典的肿瘤相关信号转导通路如WNT通路活化为主。在不同的免疫评分类型间，CXCR3、CXCL9、CXCL10、IL2在评分为HIGH的患者中表达较多，VEGFA在评分MIX及LOW的患者中较多，这种现象提示免疫豁免（浸润免疫炎症细胞）可能与固有免疫感应阶段和效应T细胞的募集的缺乏相关。
图注：肺鳞癌中趋化因子在不同免疫评分类型中的分布 PD-L1及CD8在TME中的表达： 在该研究中，分别以H-score大于1%和和50%为界值，PD-L1的阳性率为63.9%及23.1%。在有吸烟史的肺腺癌患者中，PD-L1在mRNA水平及蛋白表达水平都较无吸烟史的肺腺癌患者高。无论在mRNA层面还是蛋白层面，CD8的阳性表达与PD-L1的表达都存在着较好的相关性。同时，该研究也发现两者的表达在瘤内和瘤间都显示出了较大的异质性，提示以活检小样本作为肺癌患者诊断分型和治疗依据的策略在未来需要得到进一步的优化。
3.分子标签及免疫分型的预后意义： 该研究评价了免疫细胞的特征性标志物、免疫分型及分子突变标签的预后意义，Tfh细胞的特征性标志物与肺腺癌患者的生存显著相关；在肺鳞癌中，KM曲线显示免疫类型评分为HIGH的患者其预后明显较评分为MIX及LOW的患者的预后好，2年生存率几乎达100%，APM、细胞毒性T细胞及树突状细胞的特征性标志物与肺鳞癌患者的生存显著相关。多因素分析显示，APM及细胞毒性T细胞特征性标志物是预后的独立预测因子。
图注：肺鳞癌患者基于免疫类型及免疫分子特征的KM曲线图 总的说来，该研究发现中国肺腺癌和肺鳞癌患者染色体上8p23.1缺失的频率较高，而西方人群则染色体上8q24.21的局灶性扩增和肿瘤抑制因子LRP1B的局灶性缺失较高。在我国非小细胞肺癌人群中，肺腺癌（72.5%）的TIL比例明显高于肺鳞癌（54.4%）；在肺腺癌中免疫细胞浸润低水平与EGFR基因突变有关，且免疫T细胞浸润与KRAS基因突变显著相关，而在肺鳞癌中免疫细胞浸润低水平则与PI3K和/或WNT途径激活有关。 CHOICE研究为中国非小细胞肺癌人群中潜在生物标志物的特征提供了全面的描述性数据。这些数据对进一步分析分子标志物、分子机制提供了重要线索。整个研究历时五年，该文在《Nature Communication》（影响因子：12.41）在线发表。张绪超教授表示，课题组还将进一步挖掘肺癌患者的免疫组学数据，期待后续发表更有影响力的成果。 吴一龙教授在该文在线发表后表示：CHOICE研究是目前中国最全的肺腺癌和肺鳞癌的免疫基因组分析，中国肺腺癌的免疫细胞标签明显高于肺鳞癌，根据基因组变异、拷贝数增加、融合基因、肿瘤突变负荷和肿瘤浸润淋巴细胞的综合计算，高综合免疫标签的患者几乎是100%的生存，优于其他的免疫标签对预后的预判。这项研究，信息量之丰富，超乎想象，还有巨大的挖掘空间！ |
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图注：肺腺癌、肺鳞癌患者的热点基因突变
图注肺腺癌（a. c）与肺鳞癌(b. d)中的突变基因谱
图注：图a为肺腺癌的免疫浸润特征，图b为肺鳞癌的免疫浸润特征
