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卢煜明教授等人在1997年发现母体血浆中胎儿游离DNA（cffDNA）启发了各种非侵入性产前筛查（NIPS）应用，避免了侵入性采样引起流产的风险。目前，基于母体血浆中cffDNA分析的常见胎儿非整倍体NIPS已逐渐应用于临床实践的一级非整倍体筛查策略。以前的大规模临床研究表明，在21,18和13三体筛查中NIPS的准确性很高，敏感性和特异性高于95％。 重要的是，NIPS的可靠性在很大程度上取决于所测试样品中是否有足够的胎儿cffDNA浓度，来自母体外周血中胎儿来源的cfDNA的百分比通常在3-30％的范围内，平均为约13％。cffDNA比例水平由多种因素决定，包括孕龄，母体体重和提取方法，此外，在NIPS的样本运输或实验室检测期间，胎儿比例可能会进一步降低。以往的研究表明，妊娠妇女血浆中非整倍体染色体异常的程度与cffDNA比例呈线性相关，因此，NIPS的测试准确性很大程度上依赖于胎儿比例。大多数现行的NIPS操作规范使用4％作为较低的胎儿比例阈值以确保可靠的结果。然而，对于早期GA阶段的妊娠或需要NIPS的肥胖女性，低胎儿比例是需要克服的主要问题，此外，NIPS错过约1％染色体非整倍性病例，与这些假阴性结果相关的最常见因素是胎儿分数低，基于上述原因，提高胎儿比例以获得令人信服的NIPS结果至关重要。 cfDNA是由凋亡细胞产生的DNA片段，其在快速DNA降解后释放到循环中。这些DNA片段的大小分布具有对应于核小体（~143 bp）和染色体（核小体+接头组蛋白; ~166 bp）的峰。在孕妇中，母体外周血中的cffDNA主要来源于穿过胎盘屏障的胎盘滋养细胞，2010年，Lo等人发现cffDNA与母体细胞的cfDNA相比具有不同的长度分布， 166 bp的分子比例减少和母体血浆中短于150 bp的分子比例增加，这可能是由细胞凋亡过程中的差异核小体包装引起的，或者是由核小体结合力的差异引起的。基于这些发现，理论上可以通过大小选择来富集来自母体外周血中的总cfDNA的cffDNA片段。 最近南京妇幼保健院许争峰院长团队与博奥生物合作，开发了一种cffDNA富集的实验方法，将cffDNA平均比例提高了1.5-4倍，而获得的cfDNA完全足够NIPS。此外，使用这种新方法回顾性地测试了1415个临床样本，包括1404个常规临床NIPS样本和11个假阴性NIPS样本，结果表明，cffDNA富集策略可以通过减少假阴性结果以及测试失败率来改善NIPS的整体性能。相关结果于2019年4月11日在线发表于权威医学期刊Journal of Translational Medicine。 富集方法 在NIPS文库构建期间，在末端修复之后和adaptor连接之前进行DNA富集。平均粒径为1μm的磁珠用于选择小于160bp的末端修复的DNA片段。为了达到最高效率，通过测试一系列不同的珠子浓度来优化这一步骤。将磁珠加入末端修复的DNA片段中，然后使管振动至少3秒，然后将管悬浮5分钟并转移到磁架上。然后将含有大小选择的DNA片段的上清液转移到另一个管中用于adaptor连接。 结果 经过富集后，小于160bp的片段比例有1.44X-2.64X增加。 分别计算每个bin代表胎儿的染色体Y reads部分，然后将其与10,000 NIPS结果的汇总数据中的部分进行比较。 在[100,110]，[110,120]，[120,130]，[130,140]，[140,150]和[150,160]的bin中，平均胎儿比例显示增加1.98倍，与汇总数据中的平均胎儿比例相比，分别为2.42,2.64,2.59,2.01和1.44倍。 使用不同剂量的定制珠粒在尺寸选择后改变reads长度分布。 重要的是，染色体Y的reads比率也增加了1.5-4倍，最显著的是1.5倍剂量的珠子（图1d）。 这些结果证明，使用1.5倍剂量的珠子的富集程序可以有效地增加cffDNA的比例。 由于cffDNA富集的过程会丢弃大多数长cfDNA片段，本文量化了富集前后测序文库的数量，发现输入cfDNA会减少约91.76％，这是该方法的主要关注点。但是经过实验验证，尽管cffDNA富集可以降低输入DNA的复杂性，但我们的程序仍然可以从母体血浆中获得完全足够的DNA来进行NIPS。 在1404个临床样本中使用cffDNA富集的NIPS性能 我们首先从1404个样本中选择了902个男性胎儿样本，并通过染色体Y的reads比率计算了他们的胎儿比例。原始NIPS结果显示平均cffDNA比例为11.3±4.2％，而NIPS与cffDNA结果的胎儿比例浓缩增加到22.6±6.6％。 为了证实胎儿部分升高是否确保了临床样本的更好表现，我们将新NIPS的1404结果与cffDNA富集与原始NIPS结果进行了比较，以及确认诊断结果和后续信息。这些结果总结在表1中。简而言之，最初的NIPS结果显示灵敏度为100％（5/5），特异性为99.8％（1394/1397），阳性预测值（PPV）为62.5％（5/8）。 新的NIPS方法显示灵敏度为100％（5/5），特异性为99.6％（1394/1399），PPV为50％（5/10）（表1）。 值得注意的是，新NIPS结果的测试失败率显著降低（0.1％vs 0.7％，P<0.01）。 使用cffDNA富集方法对11个假阴性样品的NIPS性能 在临床上，NIPS假阴性的原因与低胎儿比例密切相关。 为了证明新方法是否可以避免假阴性结果，收集了来自超过常规100,000例普通NIPS病例的总共11个恢复的假阴性血浆样品。通过使用cffDNA富集后的NIPS，胎儿组分显著增加1.9-2.7倍（P <0.01）。重要的是，11个样本中有5个（45％）使用新方法返回了阳性结果（表2），这5个阳性结果与胎儿的验证性核型分析结果一致。 我们的数据表明，cffDNA富集可以有效降低NIPS的假阴性率。 结论 该研究表明通过选择性富集短cfDNA片段来增加cffDNA比例是可行的。 虽然在NIPS中使用cffDNA富集会略微降低特异性，但这种新方法可以避免大多数测试失败的案例，并减少由胎儿低比例引起的假阴性结果的近一半，从而提高NIPS在临床上的整体表现，本文的数据还表明了将来使用NIPS检测CNV和单基因疾病的可行性。 广告 |
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