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随着胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA, cffDNA）和肿瘤游离DNA（cell-free tumor DNA, ctDNA）在孕妇和肿瘤患者体内的发现，临床上对应了2个火热的领域：无创产前检测（NIPT）和肿瘤的液态活检（Liquid Biopsy）。对cffDNA的检测已经覆盖很多方面，诸如胎儿性别的鉴定、RhD血型的鉴定、单基因孟德尔遗传疾病的分析和染色体整倍型的分析等等。尤其是染色体整倍型的分析，截止目前已经在全球范围内广泛进行。随着cffDNA对于NIPT明确的临床意义和随之而来商业上的成功，近几年来人们开始聚焦ctDNA在肿瘤液态活检中的种种应用。结合肿瘤在基因层面的各种驱动机制，对ctDNA的分析大体上可以分为4类：单碱基突变（SNP）、拷贝数变异（CNV）、融合基因和甲基化修饰。虽然cell-free DNA在临床上的应用越来越深入，但对其生物学特性的了解还非常不够，甚至可以说是匮乏。本期介绍香港中文大学卢煜明（Dennis Lo）的综述，该综述冷静地回到根本性的问题：介绍各种循环DNA的长度分布、对应的分析方法以及利用cfDNA的长短进行临床诊断的可能性。凝胶电泳。如下图所示，电泳经染色后存在规律性的条带，条带的间隔约180bp，正好对应一个核小体单位的大小。这种规律性的间隔主要是由细胞凋亡过程中降解的DNA所产生，肿瘤患者和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）患者的血浆内也存在类似的电泳图谱。凝胶电泳的主要不足在于分辨率不够，不能用来进行cfDNA片段长度的分布研究。荧光定量PCR。利用这种方法可以针对已知序列设计引物，并且设计不同扩增子长度的引物对。根据cfDNA的特点，扩增子产物较短的引物对能得到较小的Ct值，利用这个特点就能计算得到样品中DNA的完整程度（integrity index）。具体设计与分析的原理见下图所示，利用该方法可以用来研究cfDNA和cffDNA之间、cfDNA和ctDNA之间的大小、含量分布。荧光定量PCR方法的限制在于只能应用于已知序列，不能用于基因组水平的分析。显微镜。采用电子显微镜（Electron microscopy, EM）和原子力显微镜（Atomic force microscopy, AFM）进行DNA的结构分析，根据1bp相当于0.34nm的对应关系来研究cfDNA的长度分布。由于EM样品制备的过程复杂，往往导致不同研究的结果出入较大。此外，EM和AFM的主要问题是：通量较低、耗时和繁琐的操作。大规模深度平行测序（Massively Parallel Sequencing or NGS）。NGS的工作原理几乎“天然地”适用于cfDNA的分析。目前采用较多的是双末端测序法（paired-end sequencing），大致的工作流程见下图。所谓“天然地”适用主要指两个方面：能够在全基因组层面进行分析；分析的精度高，可达单碱基的水平。虽然血浆内存在循环游离DNA（cfDNA）最早被发现于1948年，但截至目前对其来源及生物学特性还存在相当多的未知。较早的放射自显影结果显示了185~200bp的DNA片段和核小体的结构高度吻合，说明cfDNA主要来自于细胞凋亡的过程，电泳结果同时也证明了肿瘤患者血浆内的cfDNA大小一般在180bp左右。目前越来越多的研究表明：相较于正常人，孕妇、肿瘤患者、器官移植患者血浆内的cfDNA长度较短。NGS结果显示血浆内主要的cfDNA长度为166bp，存在以10bp为单位的递减规律，并在143bp处也有明显存在（见上图），表明cfDNA的形成主要与细胞凋亡过程中的酶解过程相关。除了上述小片段的cfDNA，还存在超过10,000bp的cfDNA，目前认为这些大片段cfDNA的产生与细胞的坏死过程相关。总体上，目前还鲜有测序结果证明有超过10,000bp的cfDNA存在。可能的原因是目前NGS的主要工作方式是基于“边合成边测序”（sequencing-by-synthesis），最近一些nanopore sequencer上产出的测序数据表明在孕妇体内存在少量大于1,000bp的cfDNA。早期基于荧光定量PCR和电泳分析的数据证实了胎儿游离DNA的长度小于母体DNA。最近NGS的数据显示孕妇体内游离DNA主要以166bp长度的形式存在，此外在143 bp处也有明显存在。胎儿游离DNA和母体DNA的区别是：143bp长度的DNA在cffDNA中显著增加，同时166bp的DNA则显著降低。利用cffDNA长度分布与母体DNA的不同，可以据此来区分染色体的非整倍性，例如唐氏综合症。具体原理见下图所示，大致的思路如下：唐氏综合症胎儿由于多了一条21号染色体，因此21号染色体对应的cffDNA/cfDNA的比例相较于正常胎儿就会上升，通过△F值（小于150bp片段的累计频率，cumulative frequencies）的计算就能进行区分。正常胎儿的△F值接近于0，而唐氏综合症胎儿的△F值则显著高于正常胎儿。相较于cffDNA，ctDNA长度分布的情况更加复杂。一般而言，ctDNA的长度小于cfDNA。因此对于肿瘤相关的突变位点检测，在扩增产物的长度选择上应尽量选择较短的扩增子，这样会提高突变的检出率。此外对存在拷贝数变异的染色体区域（扩增或缺失），类似于cffDNA的检测方法，通过NGS的Z值分析能够用来检测肿瘤相关的CNV。具体原理见下图所示。在游离DNA的领域除了cffDNA和ctDNA之外，在接受器官移植（例如骨髓移植和肝移植）患者体内的游离DNA也是个很好的循环游离DNA长度分布研究方向。目前的研究发现供体器官产生的游离DNA（对于这种来源的游离DNA貌似还没有统一的简称，陈斯卡就姑且命名为：cell free donor DNA）与受体的游离DNA存在差异，利用这种差异甚至能够作为移植手术后器官排斥的分子标志物。现在循环游离DNA在无创产前检测上有了明确的应用，在肿瘤液态活检的应用价值也日益清晰。除此之外，已有针对在中风、自身免疫病和心肌梗死等疾病状态下患者cfDNA的性质而进行的研究。近期一项研究得到的NGS数据表明，系统性红斑狼疮患者cfDNA中小于115bp的片段含量远高于正常人，这种小于115bp的cfDNA片段占到SLE患者总游离DNA的80%以上。此外，这种小于115bp的cfDNA含量与SLE疾病进展及抗双链DNA抗体的浓度呈正相关。具体结果见下图。现在anti-dsDNA抗体已经成为SLE的诊断标准之一，随着对SLE患者游离DNA研究的深入，cfDNA将来也可能作为诊断的分子标志物。 陈斯卡曾经拜访过Dennis Lo的实验室，实验室门前的铭牌上写着Circulating DNA Testing Lab。从这篇综述来看，卢教授除了采用NGS和digital PCR两种平台对循环游离DNA进行计数研究外，还把cfDNA的长度作为分子检测的一个维度。这种思路聪明之处是：如果cfDNA的长度确实可以作为各种疾病或生理状态明确的指标，那么就能利用cfDNA的物理特性达到检测的目的，诊断结果将会非常可靠。另一方面，这种思路实现的难度还是很大，因为对循环游离DNA的生物学背景还存在太多的未知。
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