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最近经常会被问到： 小囧：静脉血，检测胎儿，WES，DNA 是总DNA 还是必须用cfDNA？ 技术：收到问题赶紧查，嗯，用cfDNA 可以检测胎儿的遗传变异。 小囧：那测序深度100乘够用吗? 技术：然后又查，似乎不够，原因是cfDNA 总量本来就少，胎儿游离DNA 更少，必须有足够的深度来保证测到足够的有效数据。 小囧：那需要多少ng cfDNA 呢？ 技术：收到，又查…….. 此处省略好多行~~ 得嘞，作为一名技术人员，是该总结总结网红cfDNA 基本知识了。 来来来，樊老师要讲课了，此处应有文章~   图A cf DNA片段示意图概述 这是一篇2016年发表在Cell 上的文章，cfDNA 含有体内核小体足迹可知其组织起源。从这篇文章中我们挖掘到我们想要的答案。 Q1 cfDNA的来源？ 如图A，细胞凋亡或坏死导致的天然染色质几乎完全降解。裸露的DNA 片段在细胞凋亡时就被胞内的核酸酶降解掉了，而蛋白结合的DNA 片段由于蛋白包被能免受核酸酶的降解被释放到血液循环中。经蛋白酶处理后，可从外周血浆中回收蛋白结合的DNA 片段。在健康个体中，cfDNA 主要来源于骨髓和淋巴细胞，但在某些疾病过程或生理条件下，可能存在来自一个或多个另外的组织的来源。 Q2 cfDNA的片段分布？ 如下图B和D，片段长度分布的peak 在167 bp 处（“核小体+连接组蛋白”对应的峰），在100-160 bp 范围内有10.4 bp 的周期性波动。 cfDNA 的片段分布与核小体的结构有关，如下图E，每个核小体单位包括一个组蛋白八聚体、DNA 分子及一分子H1 ；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构（NCP，nucleosome core particle）；146 bp 的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白H1 在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA 的进出端，起稳定核小体的作用。 图B-F cfDNA片段分布和核小体结构示意图 因此不难理解cfDNA 的片段分布特点，如图F，核酸酶会降解相邻核小体之间的连接DNA，即裸露的DNA，缠绕在NCP 上的DNA 会被保护，缠绕在核心颗粒上的147bp 加上H1蛋白结合的20bp 对应着167bp 的主峰（本篇文章是167 bp的主峰，有的文章是166bp），这些DNA 会发生与DNA 螺距相关的切口或者裂解，对应着100-160bp 的范围。 Q3 cfDNA的含量？ 普通健康人中 cfDNA 含量低，超过 90% 的健康个体每毫升血浆中的 cfDNA 量不超过25ng。 在孕妇中，胎儿的cfDNA 来自于胎盘滋养层，现在cfDNA 可用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，这就是当前火热的无创唐氏筛查的基础！一般情况下，胎儿的游离DNA 含量较低，有研究表明12孕周后的胎儿游离DNA 含量较稳定，达4%以上，可满足NIPT 的检测需求。 Q4 cfDNA稳定吗？ 研究表明，cfDNA 的半衰期仅有1~2个小时，在外周血中处于一个动态的不断变化的过程，其含量取决于cfDNA 的来源。因此收到用于cfDNA 检测的全血样本时，最好是先提取。如果没法立刻提取，需要先将血浆离心出来，然后放到 -80度存放。不过市面上有卖能保存一定时间的全血样品中游离cfDNA 的保存管。 Q5 什么是ctDNA（circulating tumor DNA）？ ctDNA 是来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA 的一种类型。两者为包含关系，ctDNA 仅为cfDNA 很小的一部分。 虽然ctDNA 所占cfDNA 的比例波动范围非常大，约0.01％～90％，有研究表明半数以上突变频率在0.4%以下，但实际上，大多数ctDNA 在cfDNA 中的占比约为0.2%。因此，ctDNA 的检测需要技术灵敏度较高，目前比较适用的技术包括数字PCR技术和结合UMI 的NGS 技术，灵敏度分别可以达到0.01%和0.1%左右。 Q6 ctDNA用于肿瘤检测的优势？ 在肿瘤患者中，ctDNA 可存在于血浆、血清、脑脊液中。ctDNA 的检测贯穿于肿瘤诊疗的全过程。 ① 在肿瘤早期的筛查中，ctDNA 检测可早于影像学发现癌症，通过抽血来检测血液 ctDNA所携带的肿瘤基因组信息，实现早发现早治疗。 ② 在肿瘤治疗的过程中，ctDNA 可提相关供肿瘤药物靶点基因的突变信息，指导医生个性化用药；也可对病人用药后的疗效进行实时监测。ctDNA 的检测尤其是对于一些晚期的难以获取肿瘤组织的患者更为重要。  图G 血液中cfDNA的释放和提取 目前市场的液体活检主要针对的是CTCs 和cfDNA，如上图G，形象的描绘除了外周血中形形色色的细胞和游离核酸。下面简单介绍下CTC。 Q7 什么是CTC（Circulating tumor cell）？ CTC，即循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。通常在临检中应用的CTC，特指在检测时仍具有活性的细胞。这里的具有活性指的是细胞是活的，能自己增殖，对药物有反应，即具有一切活细胞的特性。另一方面，活的CTC提供的信息更多。 Q8 CTC 的含量？ 释放到血液中的绝大多数 CTC 发生凋亡，只有极少数细胞能存活下来并在合适条件下重新穿出血管，最终在适宜的器官形成肉眼可见的转移。有研究表明，CTC 的半衰期只有 1.0 ~ 2.4 h。因此CTC 在外周血的数量极其稀少，通常每1×106 ~ 1×107个单核细胞中才会发现一个 CTC。 Q9 CTC 检测临床意义？ CTC 检测的临床意义主要体现在以下几个方面: ① 早期发现微转移：有研究表明 CTC 检测有助于早期发现结肠癌及可能出现的微转移； ② 评估预后：Cristofanilli等在一项多中心、前瞻性、随机双盲临床试验中，检测 177 例转移性乳腺癌患者 7.5 ml 外周血中CTC 的数量，发现治疗前外周血中 CTC≥5 个 / 7.5ml 外周血患者与 CTC ＜5 个 / 7.5 ml 外周血患者相比，预后较差， CTC 可作为转移性乳腺癌患者预后评估的独立预测因素； ③ 指导个体化治疗: CTC 计数和分子分型为制定个体化治疗方案提供依据。 |
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