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PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 PCR引物的设计原则： [1] 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 [2] 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 [3] 引物长度一般在15~30碱基之间。 [4] G+C含量在40%~60%之间。 [5] 碱基要随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 [6] 引物自身不能有连续4个碱基的互补：否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性 [7] 引物之间不能有连续4个碱基的互补：两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 [8] 引物5′端可以修饰。 [9] 引物3′端不可修饰。 [10] 引物3′端要避开密码子的第3位：如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 |
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