Cell Sci Adv共同关注丨抗体非依赖m6A精准鉴定方法，助力解决领域内重大争议

N6甲基腺嘌呤修饰，即m6A修饰，是真核生物mRNA上含量最多的修饰类型【1】，参与了mRNA分子经历的各个阶段，包括可变剪接、翻译、降解等，并调控神经发育、免疫应答、DNA损伤修复等生理过程【2-4】。

如今m6A是RNA表观遗传领域的研究热门，然而自1974年被鉴定【5,6】，m6A也坐了38年的冷板凳，最主要的原因是缺乏对mRNA上具体m6A修饰位点的鉴定方法 （生信宝典：一个修饰是否重要主要取决于其是否可逆，杨云贵和何川老师去修饰酶的发现引发了m6A研究的热潮）。

2012年，基于m6A抗体的测序技术，包括m6A-seq, MeRIP-seq【7,8】的开发，使m6A修饰位点的鉴定得以实现，开启高通量测序对m6A修饰检测的研究热潮。该方法为理解m6A的分布和保守性立下汗马功劳，并促进了m6A的功能和作用机制研究。

然而基于m6A抗体的MeRIP-seq存在局限性：

1. 分辨率较低，只能确定100 nt左右的RNA片段中是否含有m6A修饰。虽然随后发表的许多研究对MeRIP-seq方法进行了不同程度的优化，试图提高MeRIP-seq的分辨率，甚至达到单碱基精度【9-14】，然而实际研究中仍然是MeRIP-seq使用更广泛；

2. 不能定量，即无法得知甲基化修饰的具体比例，m6A-LAIC-seq通过加入spike-in的方法来弥补这个缺陷；

3. 需要大量的样本投入用于免疫沉淀反应，不适于某些珍贵的样本如早期胚胎或病理样本，且实验步骤复杂。因此，需要开发快速准确且具有单碱基精度的m6A测序方法。

近日，Science Advance和Cell共同发文关注新型m6A 位点鉴定方法。

2019年7月4日，中山大学骆观正教授研究团队在Science Advance发表研究Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method，报道了一种新的不依赖于抗体的高通量m6A检测方法 (m6A-sensitive RNA-Endoribonuclease-Facilitated sequencing, m6A-REF-seq)。 

MazF是一种特异性地切割RNA上ACA motif的5'端（生信宝典：m6A修饰倾向于发生在RAC/RRACU），而不能够酶切带有m6A修饰的(m6A)CA motif的RNA内切核酸酶【15】。也就是说，MazF是否切割某段带有ACA序列的RNA，可反映该RNA是否携带m6A修饰。

基于此，研究者在MazF处理后，对酶切的mRNA片段进行修复、连接接头、PCR建库测序、通过分析酶切位点是在测序reads的内部还是端点来鉴定m6A修饰位点。为了降低假阳性，研究者使用m6A去甲基化酶FTO在体外处理mRNA作为负对照，只有在FTO处理组中甲基化比例降低的位点才被认为是准确的m6A位点（下图）。

使用m6A-REF-seq，研究者对HEK293T细胞系mRNA的m6A修饰进行鉴定，得到了4260个高置信度的m6A修饰位点，这些位点的分布与MeRIP-seq测序的结果非常相似，呈现出经典的在终止密码子附近富集的模式，且主要存在于经典的DRACA或RRACA motif中。

整体思路如下：有内部ACA motif的reads与同一位置无ACA motif的reads的比值定义为m6A修饰强度。FTO处理的样品默认无m6A修饰，视为背景。在背景样品中显著降低的m6A位点视为真正的修饰位点。（有点曲线救国，如果能改造后识别切割有修饰的位点就好了）

为了验证验证该方法的准确性，研究者使用基于连接酶的方法对部分位点进行了验证。主要步骤是针对特定m6A位点上下游设计probe，由于T3连接酶对m6A修饰位点存在位阻效应，连接效率低于正常A位点，再通过通用引物PCR的方法，即可在琼脂糖胶上验证该点是否是m6A修饰位点。同样以FTO处理样本作为负对照，m6A-REF-seq的准确性高于基于m6A抗体的测序方法，包括m6A-CLIP, miCLIP-CITS,miCLIP-CIMS和MeRIP，证明该方法有较高的准确性。

该研究通过使用MazF这种能够特异性区分m6A修饰的内切核酸酶，建立了m6A-REF-seq这个不依赖于抗体的m6A修饰检测方法，为m6A修饰位点的精确鉴定提供了新的方法。

骆观正教授年轻有为，回国仅两年，主要作者发表3篇文章，优青获得者。博士后期间开创性的发现了DNA上的6mA修饰的存在 （N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas. Cell），在其独立后继续DNA 6mA的研究发现其可以介导核小体定位 (N6-methyldeoxyadenosine directs nucleosome positioning in Tetrahymena DNA, Genome biology)。在最近火热的肠道菌群方向发现哺乳动物肠道菌群调控宿主RNA甲基化修饰特征 （Transcriptome-wide reprogramming of N6-methyladenosine modification by the mouse microbiome，Cell research）。

无独有偶，6月27日以色列魏茨曼科学研究学院Schraga Schwartz组在Cell发表了论文Deciphering the 'm6A Code' via Antibody-Independent Quantitative Profiling，同样利用MazF酶对m6A修饰的特异性识别，建立了检测m6A修饰的MAZTER-seq方法，使用了与骆观正研究组相同的建库策略。

在MAZTER-seq方法建立后，研究者对所鉴定的m6A位点进行了分析，期望寻找出m6A修饰位点的规律。确实，研究者发现m6A属于“硬编码”，即受本身RNA一级核苷酸序列的影响（in cis调控），可通过简单的方法对33%~46%的m6A位点进行预测。

同时，在MAZTER-seq测序分析中，研究者得到了两个具有争议的实验结果。

1. 在小鼠胚胎干细胞分化过程中，整体m6A水平未发生变化。而2015年Jacob H. Hanna等在Science发表研究m6A mRNA methylation facilitates resolution of naïve pluripotency toward differentiation，发现METTL3介导的m6A修饰在胚胎干细胞分化中发挥重要功能。因此，研究者认为METTL3在mESC中发挥的重要作用并不是由于METTL3对m6A位点的重分配造成的，而是由于m6A信息解读的改变，比如，通过不同的阅读蛋白。

2. 在敲低或过表达FTO后，整体m6A水平无明显变化。因此研究者认为FTO不是mRNA m6A去甲基化酶，而是snRNA m6Am的去甲基化酶。（编者注：事实上，关于FTO m6A去甲基化酶的争论一直存在，从m6A到m6Am，从mRNA到snRNA，FTO的作用底物经历了数次变革。详见BioArt报道： NCB | 这一次FTO是snRNA m6Am去甲基化酶）。

该研究在不依赖于m6A抗体的高通量测序方法MAZTER-seq的开发和建立的基础上，对m6A位点和其参与的生命过程进行了分析，对基于m6A抗体依赖的测序方法得到的研究成果提出了新的思考。

值得注意的是，这两篇文章几乎同时发表，但各有侧重。骆观正组的m6A-REF-seq更多关注的是m6A修饰位点定性的准确性，阐释了m6A-REF-seq拥有m6A定量的潜力，并探究了m6A修饰在物种间的保守性。而Schwartz组的MAZTER-seq在m6A定量方面做了很多工作，将m6A研究从定性领域推向定量领域。

然而，基于内切酶的m6A位点鉴定方法目前还存在限制。MazF酶只能识别ACA motif，而该motif只占m6A经典DRACH motif的16%左右，所以无论是m6A-REF-seq还是MAZTER-seq尚不能覆盖所有可能的m6A位点。

因此骆观正组还对其他存在于细菌TA系统中的RNA内切酶进行了筛选，筛选出能够识别UAC motif的ChpBK酶，说明细菌TA系统中的RNA内切酶可能都拥有识别m6A修饰的能力。同时也尝试突变MazF的特定位点以扩大其识别的序列范围，虽然突变的MazF酶对motif识别的结果并不理想，但是却保留了其对m6A甲基化的识别能力，说明识别m6A甲基化的能力可能是这一类内切核酸酶所共有，未来通过定向进化或者其他筛选方式有望找到更符合经典DRACH motif或直接识别A和m6A的内切核酸酶。

但同时，方法的建立还是为了解决实际问题，m6A领域有太多的争议，期待更完善的m6A位点鉴定方法的开发，让我们更全面的审视m6A。

原文链接：

https://www./science/article/pii/S0092867419306762；

https://advances./content/5/7/eaax0250

参考文献

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