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N6 - 甲基腺苷（m6A） 图丨 mRNA 修饰途径方法（来源：Cell） 早在 20 世纪 70 年代，科学家们就在 RNA 中发现了 m6A 修饰，但一直由于技术制约其功能未能被很好的揭示。直到 2012 年，科学家们的研究表明，m6A 修饰和 mRNA 的稳定性、剪接加工、翻译以及 microRNA 的加工有关。此外，m6A 还和干细胞命运、生物节律相关，可以促使干细胞从自我更新状态转向细胞分化，研究人员发现，甲基化会缩短 mRNA 的半衰期，减少其丰度。可以说，m6A 修饰几乎影响 RNA 代谢的每个步骤。 mRNA 中 m6A 修饰研究虽然已经取得了实质性进展，但仍然存在一些技术挑战和基础科学问题。第一，目前在转录组范围内检测 m6A 的方法主要依赖于 m6 A 抗体富集，与其质量密切相关，抗 体选择不当将造成假阳性；第二，MeRIP-Seq（RNA 甲基化测序）方法只能将 m6A 残基定位在 100~200nt（nucleotide，nt 指核苷酸）的转录本区域中，无法在全转录组水平上鉴定 m6A 的精确位置；第三，其它 RNA 结合蛋白免疫沉淀方法一样，对于一些小样本或珍贵样品不适用；第四，为什么 m6A 甲基化酶只对一些 mRNA 起作用而不是全部，是否还存在其它甲基化相关酶以及这些酶之间是如何协调作用的？第五，其它 RNA 修饰与 m6A 之间是否存在联系，它们是否一起调节某种转录物的生物学过程？这些问题仍有待进一步研究。 2'-O - 甲基化（Nm） 关于 5'帽子的 2'-O- 甲基化修饰（Nm），一般认为 5'帽子可以促使 mRNA 和核糖体的结合，能有效地封闭 RNA 5'末端，以保护 mRNA 免疫 5'核酸外切酶的降解，增强 mRNA 的稳定性。此外，5'帽子还参加 mRNA 前体的剪接，参与 mRNA 3'末端多聚腺苷酸化，mRNA 从核中到细胞质中的运输也需要 5' 帽子的参与。 1998 年，Wei 等发现帽结合蛋白（cap binding protein，CBP）可以与 ploy(A)绑定蛋白 (PABP) 相互作用，拉近了 5'帽子与 ploy(A) 尾的距离，形成的环状结构可以加强帽结构与 CBP 的 亲和力，加快核糖体的循环，从而提高翻译效率。(图 A) 图丨 5'帽子的功能示意图（来源：生命科学） 2010 年，Daffis 等发现病毒 RNA 5'帽子的 2'-O - 甲基化修饰可以使其逃脱宿主的抗病毒应答，细胞质 RNA 5'帽子的 2'-O - 甲基化修饰可能是宿主区分自身 RNA 和外来 RNA 的一个重要标识。哺乳动物细胞对 5'帽子没有 2'-O - 甲基化修饰的病毒具有天然的免疫，因为 IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopetide repeats 1，干扰素诱导的四肽重复蛋白 1） 可以与这类病毒 mRNA 结合，使其不能被翻译。（图 B） 假尿嘧啶（ψ） 假尿嘧啶修饰是最丰富的 RNA 修饰，一般由尿苷的异构化产生，已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。mRNA 假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶（pseudouridine synthases，PUS）进行催化，让尿嘧啶核苷酸（U）化学结构发生改变，形成假尿嘧啶核苷酸。之前研究已在 tRNA、rRNA、snRNA 中发现了大量的假尿嘧啶，最近的研究证实假尿嘧啶同样存在于 mRNA 中。 2011 年，Karijolich 等发现，mRNA 上的假尿嘧啶化修饰可以改变密码子。将酵母中的密码子中的尿嘧啶 (U) 替换为假尿嘧啶，这些密码子就能编码氨基酸，2014 年，Schwartz 等发现，酵母发生热休克时，会由 Pus7p（一种蛋白） 额外引入超过 200 个假尿嘧啶修饰位点，如果敲除 PUS7 基因，则那些含有新引入修饰的 mRNA 会减少，这说明着假尿嘧啶修饰可能会增强转录本稳定性。 虽然以上三种修饰已被广泛应用于 mRNA 药物的生产过程中，但关于 mRNA 修饰点位的探究才刚刚开始，检测技术的局限性仍有待突破。ψ-seq 和 RiboMeth-seq （两种测序技术）对假尿嘧啶化修饰和 2'-O - 核糖甲基化修饰位点的定位可以达到单核苷酸的精度，但对 m6A 位点的定位精度还不够高。 此外，还有很多 RNA 修饰缺乏相应的技术手段去深入研究。因此，在技术方面还需要有更多的 “NGS+” 型(传统检测手段与高通量测序相结合)的高通量技术产生。最近，纳米孔技术是一种新颖的单分子方法，已显示对 m6A 的单碱基分辨率检测，科学家认为，这种单分子方法可能会成为一种新颖的范例，可以同时检测不同的 RNA 修饰。 参考： doi：10.1016/j.cell.2018.06.046 doi：10.13376/j.cbls/2016069 -End- |
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