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编译：秦时明月，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 目前有160多种不同的已知RNA修饰作用，统称为表观转录组。其中，在mRNA中发现了一些修饰作用，揭开了基因调控的新面纱。表观转录密码的全转录组图谱及RNA修饰过程中动态安装修饰的编写器(writers)、移除修饰的擦除器(erasers)和识别化学修饰位点的读取器(readers)的发现，为深刻理解表观转录组打下了基础。随着生物技术的发展，科学家已经能够在全转录组范围内分析拟南芥中几个mRNA的修饰，这为了解调控这些修饰的机制及其对植物发育的影响提供了关键的参考。本文综述了表观转录组学的技术创新和最新进展，并重点介绍了N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、尿苷化及其在植物发育过程中的多重作用。 论文ID 原名：Messenger RNA Modifications in Plants 译名：植物中信使RNA的修饰 期刊：Trends in Plant Science IF：14.008 发表时间：2019.02 通讯作者：Lisha Shen, Hao Yu 通讯作者单位：新加坡国立大学 DOI号：10.1016/j.tplants.2019.01.005 主要内容 1 理解mRNA修饰：植物表观转录组学 到目前为止，已经发现了160多种不同的RNA修饰作用。这些修饰大多数都是在高丰度的非编码RNA(ncRNA)中识别和深入研究的，如rRNA和tRNA。由于近年来在RNA修饰检测和高通量测序方面的技术进步，低丰度RNA中RNA修饰的新功能和新角色正在迅速被发现，包括mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)和小RNA(miRNA)。这导致了与迄今大部分未知的基因调控机制相关的新的RNA修饰作用的发现，并使得专注于破译RNA修饰功能的表观转录组诞生。 越来越多的证据表明，动态的mRNA修饰可能是植物新陈代谢的关键控制开关，如RNA衰变、翻译效率、核保留和剪接。到目前为止，在哺乳动物的mRNA中已经发现和定位了几种广泛的mRNA修饰，包括众所周知的m7G、m6A、m6Am、 m1A、m5C、hm5C、Nm、肌苷、假尿苷以及尿苷化。除了这些表观转录密码的全转录组图谱外，对mRNA修饰过程中的编写器、擦除器和读取器的特征分析也有助于我们逐步理解表观转录组及其在生物体中的作用。 到目前为止，已知的拟南芥mRNA表观转录组包括m7G，m6A、m1A、m5C、hm5C和尿苷化(图1)。多种高通量测序技术的应用使得m6A和m5C的全转录组图谱的构建成为可能，并发现mRNA转录本具有不同的分布模式，同时证明了拟南芥mRNA中尿苷酸的普遍存在。拟南芥mRNA中m1A和hm5C的存在已被液相色谱-质谱实验(LC-MS/MS)揭示，而其他mRNA的修饰，包括3-甲基细胞素(m3C)和1-甲基鸟苷(m1G)，已通过一种名为高通量核糖核苷酸修饰注释的计算方法预测，该方法可以检测出影响Watson-Crick碱基对的修饰作用。 2 mRNA修饰作用的检测：新兴技术 20世纪70年代，随着在哺乳动物细胞和植物中发现了m6A，科学家们发现了真核mRNA的化学修饰作用。然而，高效分析工具的缺乏限制了化学修饰作用在转录组水平上的分析。最近的一些研究揭示了低丰度mRNA修饰的转录组图谱及其在基因调控中的作用，这在很大程度上归功于各种定位RNA修饰的检测方法的迅猛发展，从而引起了科学家们对mRNA修饰的兴趣(表1)。 (1) m6A的检测 m6A是真核细胞mRNA最普遍的修饰作用，并已在酵母、植物、果蝇和哺乳动物中发现。检测m6A的方法有多种，包括二维薄层色谱(TLC)、特异性m6A的斑点印迹以及LC-MS/MS等(表1)。薄层色谱是根据甲基化核苷和未甲基化核苷在溶剂中的不同迁移方式，通过在纤维素平板上区分甲基化核苷和未甲基化核苷来进行检测的。斑点印迹法可以检测总m6A水平的质的变化，而LC-MS/MS是m6A水平的高灵敏度定量测量。通过两种独立的方法在哺乳动物中首次获得了m6A的全转录组图谱，称为m6A-seq和甲基化RNA免疫沉淀测序(MERIP-seq)。这些方法利用特定的m6A抗体从碎片化的总RNA或mRNA中富集m6A修饰的片段，然后进行高通量测序(图2A)。这些研究和随后在酵母和植物中的应用揭示了保守的m6A分布富集在3’非翻译区(UTR)和近终止密码子区段中(图2B)。 虽然m6A-seq/MERIP-seq是目前应用最广泛的鉴定含m6A转录本片段的方法，但它们不能准确定位RNA转录本上的m6A位点。而进一步发展的几种方法，包括光交联辅助的m6A测序 (PA-m6A-seq)、m6A单核苷酸分辨交联免疫沉淀(MiCLIP)和m6A交联免疫沉淀(m6A-CLIP)(表1)，将UV诱导的RNA抗体交联策略与m6A-seq/MERIP-seq结合以提高m6A测序的分辨率。此外，能够分析m6A化学计量的技术也已经开发出来，利用位点特异性切割和放射性标记，然后连接辅助提取、薄层色谱和基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法可以准确地测定特定位点的m6A修饰部分，而m6A水平和异构体特征测序(m6A-LAIC-seq)可以在转录组水平定量测定m6A水平或化学计量。这些改进的研究方法还没有在植物中进行过测试。 (2) m5C和其他RNA修饰的检测 检测m6A水平总量的方法，如TLC、斑点印迹和LC-MS/MS，也可用于确定其他mRNA修饰的水平，如m1A、m5C和hm5C(表1)。同样，m1A、m5C和hm5C的全转录组图谱，包括m1A-seq、m1A-ID-seq、m5C RNA免疫沉淀深度测序(m5C-RIP-seq)，都是基于m6A-seq/MERIP-seq的程序开发的(图2A和表1)。除了m5C -RIP-seq，将改良的亚硫酸盐处理与下一代测序相结合的亚硫酸盐测序(BS-seq)也被用于绘制哺乳动物细胞和植物中的m5C位点。与100-200nt分辨率的m5C-RIP-seq相比，BS-seq在单碱基分辨率下也能准确识别出m5C位点，但其有两个缺点。首先，BS-seq不能将m5C与真核mRNA中的其他胞嘧啶修饰区分开来，例如hm5C。其次，亚硫酸盐处理会导致RNA降解，并限制含有m5C的RNA的富集，从而阻碍了其在低丰度RNA中检测m5C的应用。此外，现阶段已经开发出了两种新型技术—5-氮杂胞苷介导的RNA免疫沉淀和甲基化单核苷酸分辨交联免疫沉淀(表1)，它们可以识别出m5C RNA甲基转移酶的直接靶标。 3 解密m6A的修饰装置：m6A的编写、擦除和读取 到目前为止，在所有已研究植物的mRNA中都发现了m6A，包括拟南芥、玉米、小麦、燕麦和水稻。在拟南芥中，m6A水平在不同组织中各不相同，从种子中的0.4%(m6A/A比率)到幼苗中的1.5%不等。在三个独立的研究中，拟南芥m6A甲基组已经被定位在不同的生态型和组织中。在两种生态型(Can-0和Hen-16)的3周龄幼苗的地上部分首次发现了拟南芥中的m6A甲基组。m6A广泛分布于5000多个mRNA转录本中，平均每个活跃表达的转录本估计有0.7-1.0个m6A。m6A不仅在3’-UTR和终止密码子附近富集（这与酵母和哺乳动物中的m6A类似），也可以在起始密码子附近富集(图2B)。在拟南芥Columbia (Col)生态型幼苗中发现的m6A甲基组进一步证实了这一模式。然而，在另一项研究中，在拟南芥的叶、花和根的m6A甲基组中没有检测到起始密码子附近的m6A富集，这可能是由于不同植物材料中m6A修饰的动态变化或使用了不同m6A抗体所致。然而，所有这些研究都揭示了拟南芥中一致的m6A甲基化基序RRACH(R=A/G；H=A/U/C)，这在酵母、植物和哺乳动物中都是保守的。保守的m6A沉积模式和基序表明，用于动态安装m6A (编写器)、移除m6A (擦除器)和识别m6A (读取器)的装置很可能在自然界各物种之间是保守的。 (1) m6A的编写 哺乳动物中的m6A是由类甲基转移酶-3(METTL3)、METTL14、Wilm肿瘤相关蛋白(WTAP)、KIAA1429/VIRMA、HAKAI、RNA结合基序蛋白15(RBM15)和含有锌指CCCH结构域的蛋白13(ZC3H13)组成的甲基转移酶复合物。在这个复合物中，METTL3是催化亚基并具有甲基转移酶活性，而METTL14不具有酶活性，但可与RNA底物结合以促进METTL3的活性。拟南芥m6A编写器复合物由mRNA腺苷甲基转移酶MTA(METTL3的同源物)、其最接近的同源物MTB (METTL14的同源物)、FKBP12 INTERACTING PROTEIN 37KD(FIP37)(WTAP的同源物)、VIRLIZER/KIAA1229(VIR)和HAKAI (图3和图4A)组成。这种拟南芥复合体表现出植物特有的两个独特特征。首先，在哺乳动物中，WTAP、METTL3和METTL14富含核斑点，可能促进了与选择性剪接相关的m6A甲基化，也就是说，m6A可以调节哺乳动物的RNA剪接。然而，植物编写器复合体中的所有成分都均匀分布在核质中，FIP37或VIR对转录组中的选择性剪接没有明显影响，表明m6A可能不是植物选择性剪接的主要贡献者。其次，在植物和其他生物之间，m6A编写器的单个成员可能存在潜在的功能差异。例如，哺乳动物中的WTAP与人类细胞中的METTL3、METTL14、VIRMA和HAKAI相互作用。相反，拟南芥中的FIP37只与MTA直接相互作用，尽管它们与复合体中的其他组分有关联。因此，虽然m6A修饰在真核生物中是保守的，但植物m6A甲基化机制及其对RNA新陈代谢的影响可能已经进化出独特的机制。 拟南芥m6A甲基转移酶复合体的核心成分，如MTA，MTB和FIP37的突变会导致胚胎死亡，这归因于球形阶段的发育停滞，这表明m6A对植物生存是必不可少的。在特异性启动子的控制下，可以通过表达相应的基因来挽救这些突变体的胚胎致死性，这使得研究这些m6A编写器在胚胎发育中的功能成为可能。通过这种方法，已经发现缺乏MTA的突变体表现出生长模式改变、顶端优势降低、花器官异常等，总m6A水平降低了近90%。同样，缺乏FIP37的突变体表现出茎尖分生组织的大量过度增殖，总m6A水平降低了85%。此外，m6A-seq已经揭示了全转录组中m6A修饰的丢失和m6A甲基组的变化。这种m6A修饰的丢失也发生在关键分生组织调控因子(如WUSCHEL和SHOTMERISTEMLESS)的转录本中，并导致这些转录本的衰退和异位积累减少，从而揭示了m6A是植物中新的基因调控元件。此外，通过RNA干扰抑制MTB的表达导致植株高度降低，而HAKAI突变体没有明显的生长缺陷，尽管其m6A水平降低到野生型水平的65%。此外，VIR的突变体也是胚胎致死的，而一个亚型的VIR等位基因在根的发育中是有缺陷的。综上所述，拟南芥m6A编写器复合体的组件在多个发育过程中发挥着至关重要的作用(图4A)。 (2) m6A的擦除 m6A是一种可逆的mRNA修饰，在哺乳动物中m6A修饰可以被两种m6A去甲基酶动态去除，这两种酶分别是肥胖相关蛋白(FTO)和α-酮戊二酸依赖的双加氧酶碱性B同源物5(ALKBH5)，这两种酶都属于ALKBH家族。拟南芥基因组共编码13个ALKBH家族蛋白。这种基因在不同的组织中有不同的表达模式，并且其编码的蛋白显示出不同的亚细胞定位模式，这意味着它们在促进m6A动力学方面的功能差异。在这些拟南芥蛋白中，ALKBH9B和ALKBH10B已经被证明可以去除m6A (图4A)。ALKBH9B具有从单链RNA中去除m6A的体外去甲基酶活性。ALKBH9B的突变对病毒聚集和系统入侵有负面影响，这与病毒RNA的m6A水平增加相关。然而，ALKBH9B对植物m6A的影响尚不清楚。相反，在植物中已经证明了ALKBH10B的去甲基酶活性。在ALKBH10B突变体中的1000多个超甲基化转录本中，m6A-seq显示m6A丰度升高。ALKBH10B介导几种促进开花调节剂的mRNA的 m6A去甲基化，从而降低这些转录本中的m6A水平，提高转录本的稳定性，从而促进花的生长。一直以来，ALKBH10B突变体都是开花较晚的。因此，到目前为止，m6A促进了拟南芥中几个关键发育调节因子的mRNA的衰退。 (3) m6A的读取 m6A修饰通过组成m6A结合蛋白，影响细胞核和细胞质RNA代谢的几乎所有方面，包括稳定性、翻译效率、核保留和剪接，这被称为m6A读取器。科学家已经发现了几类m6A读取器，包括含有YTH结构域的蛋白和异质性核糖核蛋白(HNRNP)家族。YTH结构域高度保守，含有该结构域的蛋白质在真核生物中广泛存在，在植物中尤其丰富。已在拟南芥和水稻基因组中鉴定出一些编码YTH蛋白的基因(分别为13个和12个基因)，这些基因在不同发育阶段、不同器官和不同胁迫条件下表现出不同的表达模式，表明其功能的多样性。在拟南芥的13个YTH结构域蛋白质中，有11个以其高度保守的C末端区域为特征在之前被称为EVOLUTIONARILY CONSERVED C TERMINAL REGIONS (ECTs)，它们直到最近才被三篇同时发表的论文发现具有m6A读取器的作用 (图4A)。ECT2在体内与m6A修饰的mRNA结合，这是维持毛状体分枝正常功能过程中必不可少的。甲醛交联和免疫沉淀实验已经确定了ECT2的全转录组范围的结合位点，特别是在其目标基因的3’UTR处。有趣的是，在ECT2结合峰中发现了一个植物特异性的URUAW(R=G/A；W=U/A)基序，这与人类YTH蛋白的基序不同。ECT2通过调节3’UTR (如长度)和增强mRNA的稳定性，在RNA新陈代谢中发挥双重作用。具体地说，ECT2增加了三个含有m6A的转录本mRNA的稳定性，这三个转录本与毛状体的形态发生有关，从而调节毛状体的发育。此外，ECT2、ECT3和ECT4冗余地作用于控制叶片形成时间和正常叶片形态的转录本 (图4A)。ECT2和ECT3的突变抑制了它们识别m6A的功能，表明特定的m6A结合活性对于叶片和毛状体发育是必不可少的。这些研究总体上证明了m6A读取器在植物发育中的关键生物学功能。由于拟南芥含有13个具有高度序列相似性的YTH蛋白，阐明它们与m6A结合的能力和构建敲除突变体将揭示它们在植物m6A表观转录组中的作用。 (4) 水稻中的m6A m6A的作用模式也在单子叶植物水稻中被研究出来，并显示出与拟南芥相似的富集模式(图2B)，表明m6A在植物中的分布是保守的。在分化的愈伤组织和叶片中，分别有8000多个和14000多个基因被m6A甲基化，而其中大量的基因只在一个特定的组织中被m6A修饰。这一结果以及拟南芥的叶、花和根中存在许多差异甲基化转录本的发现，表明特定转录本上的动态m6A修饰可能是植物组织或器官分化的一个组成部分。值得注意的是，水稻愈伤组织和叶片中选择性甲基化基因m6A峰周围的两个保守基序与RNA结合蛋白的基序相似，如pumilio家族RNA结合蛋白、RNP4F和TRA2，表明这些基序在RNA结合蛋白和m6A编写之间可能存在竞争或相互加强的作用。尽管对水稻m6A作用模式的研究已经取得了进展，但水稻中m6A编写器、擦除器和读取器在介导m6A修饰中的功能及其对水稻发育的影响仍有待研究。 4 解密植物m5C的修饰：m5C与根系生长 m5C修饰已经在各种植物的mRNA中被发现，包括拟南芥、紫花苜蓿、水稻、玉米和谷子。在拟南芥中，m5C在不同组织中的水平不同，从莲座叶的0.010%(m5C/C比)到角果的0.036%不等，而其水平在营养生长过程中逐渐增加，这表明m5C在植物发育过程中是动态变化的。两个独立的研究已经应用不同的方法来研究m5C RNA修饰位点在拟南芥中的转录组分布。BS-seq已经在角果、茎和根中发现了一千多个m5C位点，但在不同组织中只有几十个位点是共同的，这表明m5C的作用具有组织特异性。相反，m5C-RIP-seq已经在幼苗的4000多个基因中确定了6000多个m5C峰。这两项研究中确定的m5C位点数量的差异可能归因于不同的考察方法和植物材料。拟南芥mRNA中m5C的分布有两个独特的特征。首先，在拟南芥中，m5C富含编码序列(CDS)，有两个峰位于起始密码子之后和终止密码子之前，这与哺乳动物中m5C的分布模式不同(图2C)。在人类细胞中，m5C主要富集在起始密码子之后的区域，而m5C位点主要聚集在起始密码子和3’UTR附近，而在小鼠中则缺乏CDS。其次，在拟南芥中发现的共同的m5C甲基化基序HACCR(H=A/U/C；R=A/G)和CTYCTYC(Y=U/C)与在人类中观察到的富含CG的区域不同。这些研究表明，m5C的甲基化机制及其生物学功能在不同的真核生物中存在潜在的差异。 在拟南芥中，tRNA特异性甲基转移酶4B(TRM4B)已被鉴定为m5C mRNA甲基转移酶(图4B)。TRM4B在体外能够催化mRNA 的m5C甲基化。TRM4B功能的丧失导致mRNA m5C水平下降，特别是在拟南芥的根中，但在气生组织中不降低，这与TRM4B突变体表现出的缺陷根表型一致。参与根发育的关键基因(如短下胚轴2和吲哚乙酸诱导蛋白16)上m5C的丢失加速了它们的mRNA衰退速率，表明m5C介导了mRNA的稳定和根的发育。此外，m5C在CDS中的定位与拟南芥中翻译活性低的mRNA相关，这与在果蝇中的发现一致。这些研究表明，m5C是一种新兴的表观转录，它影响了植物RNA新陈代谢的不同方面，包括mRNA的稳定性和翻译效率(图4B)。 值得注意的是，TRM4B也被报道为tRNA甲基转移酶，TRM4B突变体也表现出tRNA稳定性降低，这表明m5C甲基转移酶在不同RNA群体中可能在催化m5C修饰方面发挥多种作用。TRM4B属于RNA(C5-胞嘧啶)甲基转移酶(RCMT)家族，在拟南芥基因组中含有另外7个成员。由于在TRM4B突变体中，m5C水平只有部分降低，因此其他成员也可能作为m5C甲基转移酶发挥作用。 5 破译植物的尿苷化作用：尿苷化与mRNA代谢 RNA尿苷化是mRNA和ncRNA 3’端的一种非模板的尿苷加成，其在包括植物在内的各种真核生物中都被检测到。在拟南芥中，尿苷化发生在mRNA、miRNA、小干扰RNA(siRNA)和miRNA导向的5’差异产物中。尽管在拟南芥中对尿苷化介导的小RNA的失活进行了广泛的研究，但直到最近才使用TAIL-seq对RNA的3’端进行深度测序来研究mRNA尿苷化及其转录组分布。TAIL-seq发现，超过30%的带有poly(A)尾巴的mRNA是尿苷化的，这表明在拟南芥mRNA中存在广泛的尿苷化，特别是尿苷化优先发生在尾长较短(<20nt)的寡腺苷酸mRNA上。 尿苷酸末端转移酶(TUTases)属于DNA聚合酶β类核苷酰转移酶超家族。在拟南芥中，携带poly(A)尾巴的mRNA主要由TUTase UTP：RNA URIDYLYTRANSFERASE1(URT1)尿苷化，这也是小RNA尿苷化所必需的。TAIL-seq显示，URT1突变体中大约80%的mRNA的尿苷化丢失。URT1功能的丧失会导致寡聚(A)尾巴的修剪和去烯基化mRNA的过度积累，这表明URT1依赖的尿苷化可以保护mRNA免受3’核糖核酸酶的溶解攻击，并防止过度的去烯基化(图4C)。这些过程是由Poly(A)结合蛋白(PABP)介导的，PABP与尿苷化的寡聚(A)mRNA尾部结合，并限制URT1介导的尿苷延伸，从而形成U形长尾。除了上述作用外，尿苷化也被认为可以标记mRNA在许多真核生物中的降解，如人类细胞。由于URT1介导的尿苷化对拟南芥的mRNA降解没有明显的影响，因此研究其他TUTase能否将植物中的尿苷化与mRNA降解联系起来将是很有意义的。 6 探索其他mRNA修饰作用：扩大植物表观转录组 除了m6A、m5C和尿苷化外，已知的拟南芥表观转录组还包括m1A和hm5C(图1)，并且LC-MS/MS已经证明拟南芥mRNA中存在m1A和hm5C。hm5C在拟南芥不同组织中的表达差异很大，在莲座叶(0.0059%)、茎生叶(0.007%)和茎(0.0067%)中hm5C/C比值相对较高，而在根中的比值较低(0.0003%)，这表明hm5C在植物中也是一种动态的表观转录密码。尽管科学家在理解hm5C和m1A方面取得了进展，但它们在植物中的转录组分布仍不清楚。 尽管在拟南芥rRNA和tRNA中已经发现了其他几种修饰作用，如Ψ，Nm和I，但它们是否存在于植物mRNA中尚不清楚。不同的Ψ测序方法已经揭示了酵母和哺乳动物中的mRNA存在广泛和动态的Ψ修饰。由于拟南芥中也存在Ψ合成酶，因此在拟南芥mRNA中很可能存在Ψ修饰。此外，Nm-seq和一种计算方法分别发现了人类mRNA中的Nm位点和A到I的编辑位点，而HAMR已经预测了拟南芥表观转录组中存在的m3C和m1G。这些RNA修饰作用在植物mRNA中的存在及其对植物发育功能的影响需要进一步的研究。 结论与展望 植物是阐明表观转录组在多细胞真核生物中生物学作用和遗传影响的独特平台，这在动物细胞中是很难实现的。最近对各种表观转录组的全转录组研究以及对拟南芥编写器、擦除器和读取器的遗传学研究表明，mRNA修饰的调控是关键植物发育过程中一种基本而广泛的分子机制，包括胚胎发育、茎干细胞发育、开花、毛状体形态发生、叶片和根的发育。由于这些过程与许多重要的农艺性状密切相关，了解和进一步有针对性地调控植物表观转录将为改良农艺性状的植物育种开辟新的途径。 对植物表观转录组的进一步研究需要解决一系列相关问题，重点是解释mRNA修饰是如何动态调节以影响不同的发育过程和植物对环境胁迫的反应。此外，开发新的实验技术也是必要的，如纳米孔测序，以单碱基分辨率绘制mRNA修饰图谱，因为由此产生的单核苷酸数据将有助于准确理解特定位点mRNA修饰的生物学功能。这将促进基于CRISPR的基因编辑的进一步应用，以直接测试改变的mRNA位点对mRNA新陈代谢和植物发育的影响。此外，最近的一项研究显示，在哺乳动物细胞中，m6A调节的组蛋白修饰是一种新的基因调控机制。这一发现证明了表观遗传学和表观转录组学之间的联系，并暗示了mRNA修饰在植物基因调控的多层控制中可能存在更为复杂的作用。 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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