一文搞定 CoIP，蛋白研究 so easy

自古真情留不住，唯有套路得人心。前一秒还你侬我侬的蛋白们，转眼就跟 DNA、RNA 甜甜蜜蜜。如何才能守住蛋白之间纯纯的爱情，本期就让我们一起进入免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）的世界。

CoIP ：实验原理

要守护爱情，先了解如何相处，一切从 CoIP 的原理谈起：免疫共沉淀是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

图片来源：赛默飞

从原理示意图可见，免疫共沉淀利用抗原 (红三角) 与蛋白 (蓝圆柱) 的特异性结合，再通过连接着树脂的抗体 (紫圆球) 去识别抗原，从细胞裂解液或者蛋白混合物中捕获与抗原相作的蛋白。

之后通过进一步洗脱，获取抗原-蛋白复合物，再对蛋白进行检测（Western Blot 或者 Mass spectra），即可获得蛋白间相互作用的信息。

实验步骤

了解了原理，再来看看操作，简单来说，可以总结为以下四个部分：

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第一步：样品制备

首先进行样品制备，以提取出想要研究的蛋白，由于不同类型的细胞裂解条件有所差异，这里不展开介绍。

注意事项：

• 细胞裂解要采用温和的裂解条件，避免破坏细胞内存在的蛋白间相互作用，裂解、洗涤时需使用非变性裂解液，如 NP-40 和 Triton X-100。

• 此外，由于不同细胞裂解条件不一样，建议通过预实验来确定最佳条件。

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第二步：固定抗体

在共沉淀之前，先将固相基质与抗体共同孵育，从而使两者结合，常用的固相基质有琼脂糖 Agarose 和磁珠 Magnetic beads。

琼脂糖 Agarose 具有简单易用，直径大，结合力强，多孔易吸附的特点；

磁珠具有直径小，背景低，抗体消耗少的特点，但操作时需借助磁力架。

注意事项：

• 抗体的选择十分重要，选经过 IP 验证的抗体，可以减少假阳性概率。

• 同时，要注意抗体/缓冲液的比例，抗体稀释过度不利于后续抗原抗体结合；而抗体过多就不能完全沉降在固相基质上，残存于上清。

• 操作时，为了避免损伤 beads，使用大口径或截短枪头进行加样。

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第三步：免疫共沉淀

根据不同的抗体结合方式，这里的免疫共沉淀步骤会稍有不同，但是本质是一样的，都是为了形成抗原-蛋白复合物。

• 如果直接使用 Protein A/G 结合的 beads，先进行细胞裂解液/蛋白混合物与抗体的孵育，再加入 beads 将蛋白-抗体复合物拉下来。

• 如果使用了交联剂将抗体与 Protein A/G 固定，或者直接将抗体固定在 beads，则将固定抗体的 beads 与细胞裂解液或则蛋白混合物一起孵育。

注意事项：

• 增加在洗脱之前的洗涤次数或在免疫共沉淀缓冲液中加入 Triton X-100 ，可以降低非特异性结合，以防止蛋白在阴性对照树脂实验样品中被检测到。

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第四步：洗脱与检测

最后一步则是使用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物洗脱，并通过 Western Blot 或者 Mass spectra 检测鉴定蛋白。当蛋白或抗体对低 pH 的缓冲液敏感，可使用中性 pH 值的洗脱缓冲液。（赛默飞温和洗脱缓冲液，产品编号：21027）

注意事项：

• 如后续需进行酶活或功能性分析，则需使用兼容下游检测的 Elution buffer 进行洗脱。

• 对于交联剂结合的 beads，为了保持抗体偶联树脂的活性，应立即再生和存储树脂，保证抗体可以重复利用。

当然，CoIP 过程中还有许多常见问题和注意事项，使用赛默飞免疫共沉淀试剂盒，可以帮您免去不少试剂耗材的选择问题，更有技术专家售后支持，帮你一路通关。

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图片来源：赛默飞、创客贴