|
2019年5月30日-6月1日，为期3天的第15届上海国际医院感染控制论坛（SIFIC）暨第3届东方耐药与感染大会（OCAMRI）联合会议在上海跨国采购会展中心成功举行。 小菌最关注的当属6月1日上午举行的“病原宏基因组测序在感染性疾病精准防控中的应用”的联合专题会。复旦大学附属中山医院金文婷医生、中国科学院大学陈唯军教授、复旦大学附属中山医院胡必杰教授、广州呼吸健康研究院卓超教授分别为我们带来了精彩的报告。 今天，小菌将和大家一起来学习陈唯军教授在主题为“T思维下的宏基因组学临床应用”报告中的主要观点。  T思维下的宏基因组学临床应用 1. 传统方法与宏基因组方法的根本区别 “假设”有/无 VS “口袋💰”有无  想找瓶子，对了！ 想找钥匙，错了！  瓶子/钥匙都在呢！ 可是，这需要好多的电费啊（reads覆盖度）！ 这么大面积，要好的搜索方法（数据库与算法）！ 传统方法鉴别微生物，每次只能鉴别一种微生物，就好像只开了一盏路灯，只能看到这盏路灯照射范围内的东西；mNGS技术，就好像开了所有的路灯，可以检测样本全部的微生物序列。 2. 临床宏基因组学方法的 局限性分析及解决方案（一） ■局限：经济成本与灵敏度矛盾 临床样本的复杂性以及很多病原体感染后含量很低，会导致限定数据量中靶病原信息太少而丢失，包括用药后取样导致的病原数量低。 ■解决方案： 扩大数据量是最简单的办法，但经济接受度总有限度。 ■数据覆盖就是硬道理   ■离开了基本数据覆盖度的宏基因组学检测就是耍流氓！ 有些公司过度成本考虑，15K的测试覆盖度也敢出报告。  继续拿路灯来做比喻：本来可以开很多灯，但是为了减少电费，就少开了几盏。  瓶子/钥匙都在呢！ 可是，这需要好多的电费啊！（reads覆盖度） 咱们省点钱，少开几盏灯多赚点吧！ ■工具驱动的病原检测技术新革命 “适当”增数据量也能承受的起啦！比如100M reads！  3. 临床宏基因组学方法的 局限性分析及解决方案（二） ■局限：孤立病例与多病原矛盾（流行病学支持不足） ■医生的疑问 为啥你给我这么多病原微生物，能不能少点啊！   1. 复杂感染本身的多病原共感染； 2. 原发感染与继发感染的多病原感染； 3. 呼吸道分泌物，肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性； 4. 宏基因组学技术算法的一对多的系统误差； 5. 生物工程检测试剂残留的微生物核酸。 ■宏基因组学往往生成一个大病原微生物表  ■临床检验是一个典型的统计学，要有不同类型样本的相关微生物基线（cutoff值） （1）要对不同类型样本，尤其是开放体系样本进行大量正常人群测试，并结合临床感染病人样本测试，获得相关cutoff值（以最大限度的提高临床符合率为参考），避免形成一大堆病原列表，导致很多正常定植菌群的出现干扰临床医生诊断； （2）某些产品自己没有做上述相关基线数据，还宣称这样会形成假阴性，但实际上敏感性与特异性是任何检测方法的一对矛盾体，单纯不做控制的所谓阳性率增加，实际是形成大量的假阳性； （3）对于临床耐药，其与耐药菌株含量存在关联，不能是检测出来了相关基因就耐药，我也看了某些产品的耐药检测报告，不做任何临床一致性评估，检测结果基本上就是临床“无药可用”的状态。 耐药基因检测结果 ■宏基因组学都是一个大病原微生物列表，只是多少区别 模 糊 比 对 的 多 病 原 相 关 性 常用宏基因分析感染病原的工具软件及其偏好性 红色代表人类病原，蓝色代表非人病原，灰色代表没有预测出来（训练集本身为非人类病毒） 特定病毒随机打断序列不同软件宏基因组学分析结果 1. 要有好的算法和分析软件，尽量避免形成一对多的模糊结果； 2. 要有病原微生物特征数据库，在模糊比对的基础上进一步进行特征数据库分析流程，将因同源性高的区域序列带来的一对多的病原微生物进一步缩减，形成尽可能准确、特异的病原微生物列表，供临床医生参考。 4. 临床宏基因组学方法的 局限性分析及解决方案（三） ■局限：临床复杂性与产品标准化的矛盾 ■医生的疑问 为啥临床感染特征明显，检测是阴性？有些真菌感染镜检形态学阳性了检测也是阴性？患者负担重，能不能RNA/DNA一起就算一个测试收患者一样多钱啊？ 1. 合适的病程，合适的取样：没取到合适的样本，一切检测就失去了基础； 2. 合适的样本处理与核酸制备：真菌有厚壁，分枝杆菌有脂质，难提取啊； 3. 合适的测试策略（测DNA or RNA?或者DNA RNA?）: 社会经济成本不一样，要有临床“假设”！病毒感染可能性不大，那就测DNA吧（这方面医生的经验非常重要，降低了社会成本）；病毒感染难以排除啊，RNA病毒咋办？这个还是同时检测RNA DNA吧（难以排出时）。 ■比如肺部局灶感染：最好做介入取样，但需要有良好经验的医师，有时BALF不知道是啥。 ■真菌的核酸提取要有破壁程序，因此，为了兼顾真菌，必须要有破壁操作程序；分枝杆菌其实好提取，现有的商品试剂非常有效。 ■合适的测试策略实际是社会经济成本：临床“假设” DNA RNA一起测序本身无任何技术难度，现在的核酸提取技术本身就可以共提取DNA/RNA，测序也本身需要构建文库，两个文库等量混合就完成了同时测试，数据覆盖度按照2个测试的量来安排，而不能只按一个测试数据覆盖度安排； 如果把两个测试的数据量降低到一个测试数据量，那理论上对两种检测的灵敏度就都降低了一倍，那实际就是偷工减料，耍流氓！ 对于病毒感染难以排除的患者，可以同时检测RNA DNA，不要先查了DNA，没有发现有效线索，又来检查RNA，那患者负担会降低一些。 5. 当前临床宏基因组产品的适用性 ■临床应用场景： （1）最主要适用方向 感染科医生难以判断是何种病原感染——没有想到暮然回首，原来是它！ （2）次要适用方向 有临床依据但缺乏病原学证据的慢性持续感染——没有做到；用特定策略的新宏基因组学产品来解决（富集深度测序，较高成本）。 （3）延伸适用的场景（科研模式） 新发病原的发现即“想不到”原则上不是临床检验的内容，检验一定是假阴性； 需要新型分析策略及系统进化数据库来解决，需要极高的成本，当前还只能是医学临床研究的重要内容。 6. 用好“临床级”宏基因组学检测产品 ■ 正确采样是关键，临床假设有必要； ■ 合适样本处理有必要：不同类型样本要有差异化处理策略，如血液、胸腹水样本要适当去人基因组成分； ■ 数据覆盖度是硬道理，不增加灵敏度的“所谓新方法”就是偷工减料； ■ 病原特征数据库与算法要有系统研发，不能简单的把公共数据库中的微生物纳入比谁多； ■ 结果判定结合临床的经验很重要 接下来，我们还会对其他专家的观点进行分享，敬请期待。 感谢陈唯军教授授权唯菌论使用其PPT内容。 |
|
|
