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hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), Muc2 (White) DAPI (Blue) hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), Vimentin (white), DAPI (Blue) hPSC-Derived Kidney Organoid, PODXL (Red), LTL (Green), E-Cad (White), DAPI (Blue) 固定 注意: 合并2-3孔的几十个类器官最为理想，但也可只使用一个孔的类器官。 使用PFA固定和O.C.T包埋的实验流程 使用1.5 mL的EP管收集类器官，使用4% PFA溶液室温固定半小时。室温下用PBS清洗3次，每次5分钟。然后将样本转移至30% 蔗糖溶液4度孵育过夜。第二天，移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分钟。将类器官转移至组织模具中，置于-20度，继续在O.C.T中进行包埋。可于-80度储存或进行冷冻切片。 使用福尔马林固定和琼脂糖包埋的实验流程 1. 从孔板中吸出培养基。加入1 mL的福尔马林。 2. 使用1 mL的枪头轻柔地重悬类器官和基质胶，将混合物转移至EP管中。将所需的所有孔的类器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中进行固定，一起重悬） 3. 轻轻混合，放在冰上孵育至少一个小时。 4. 4度，1500 rpm，离心5分钟。 5. 小心地吸出福尔马林。 6. 用冰冷的PBS清洗，4度，1500 rpm，离心5分钟，小心吸出PBS。重复至少两次。（为了帮助去除Matrigel，也可加入Cell recovery medium，冰上孵育15-30分钟） 7. 使用冷的福尔马林重悬将类器官，4度孵育过夜。 注意：染色方面，类器官切片的处理方式与其他组织切片一样，使用一般脱蜡，补液，抗原修复等的常规步骤。 hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), KRT20 (Red), Desmin (White), DAPI (Blue) 8. 准备模具：准备1条8-strip PCR管，分成单个管，切掉管的下半部分，得到一个圆环作为模具。将模具放到培养皿中，使其与底部平齐，然后放在冰上。 9. 使用福尔马林轻柔的混合类器官，4度，1500 rpm离心5分钟。轻轻吸出福尔马林，不要接触到沉淀的类器官。如果观测到成块的基质胶，可使用BD cell recovery medium冰上孵育30分钟。再次离心，尽量吸出所有的液体。 10. 使用无菌的PBS配制3% 低融点的琼脂糖。使用微波炉加热至完全融化。 11. 趁琼脂糖溶液还保持温热的液体状态时，使用75 µL的琼脂糖液体轻柔地重悬类器官。如果使用 200 µL或更小的枪头，剪掉枪头尾部，防止损伤类器官。 12. 立即将重悬后的类器官和琼脂糖液体转移入冰上放置的培养皿中的模具中。琼脂糖会立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以内），否则琼脂糖会在枪头中固化，造成样本的损失。避免引入气泡，但少量的气泡可能无法避免。 13. 在倒置显微镜检查琼脂糖包埋的类器官的数量，质量和位置。 14. 在4度孵育1个小时以上，确保琼脂糖固化完成。 15. 从模具中取出，转移到组织盒中，使用70% 乙醇储存。 hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), E-Cad (white), DAPI (Blue) 补液，抗原修复和染色 补液（Rehydration） 1. 把切片放入接近沸腾的热水中加热11分钟。（切片应放入切片盒内，且保持干燥。） 2. 使用组织级别的二甲苯里清洗2分钟。重复4遍。 3. 使用100% 乙醇清洗5分钟。重复2遍。 4. 使用90% 乙醇清洗5分钟。 5. 使用70% 乙醇里清洗5分钟。 6. 使用dH2O清洗5分钟。 注意： - 免疫荧光染色（Immunofluorescent staining ），请继续进行第7-18 步 - H&E 染色（H&E staining ），请继续进行第19-24步 - 阿尔新蓝染色（ Alcian Blue staining），请继续进行第25-32步。 抗原修复 7. 将切片放入密封的切片盒中。使用微波炉将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% tween-20，pH 6.0）加热至沸腾。用缓冲液加满切片盒，没过所有的切片。 8. 将放有切片的切片盒和缓冲液置于蒸器中30分钟。（需要保持温度接近沸点，而不要到达沸点。） 9. 将切片从柠檬酸钠缓冲液中取出，短暂降温，然后用PBS缓冲液清洗2分钟。 染色（免疫荧光） 10. 晾干切片，使用免疫组化笔标出类器官切片的部分。 11. 使用适合的封闭缓冲液在室温封闭1小时（或按照常用的封闭方法进行封闭）。 12. 加一抗，室温孵育2小时，或在4度孵育过夜。 13. 用PBS清洗2次，每次2分钟。 14. 加二抗，室温孵育1小时。避光。 15. 用PBS清洗两遍，用dH2O清洗一遍。每次2分钟，晾干。 16. 在每个切片上加一滴含DAPI的ProLong® Gold防猝灭封固剂，轻轻覆盖一片盖玻片。用一个200 µL枪头轻压盖玻片，压出气泡。静置10-15分钟。 17. 使用透明的指甲油封上载玻片，晾干15分钟。 18. 使用荧光显微镜观察。 染色（H&E） 19. 把类器官部分放在haematoxylin里5分钟，然后使用自来水清洗1分钟 。 20. 对类器官切片进行染色（如苏木精染色），可以用碳酸锂或“Scott’s tap water” 染色1分钟，然后用自来水清洗一分钟。 21. 将切片放在1% acid alcohol里30秒，用自来水清洗1分钟。 22. 把切片放入eosin（伊红）内染色5分钟，用自来水请洗1分钟。 23. 脱水：使用95% 乙醇脱水10分钟×2。使用100% 乙醇脱水3分钟×2。使用二甲苯脱水5分钟×3。 24. 使用封固剂将切片固定，用指甲油密封。 染色（阿尔新蓝） a) 3% 醋酸溶液：冰醋酸 3 mL，dH2O 97 mL b) 阿尔新蓝溶液 （Alcian Blue solution） pH 2.5：dH2O 97 mL，3% 醋酸溶液 3 mL，阿尔新蓝 （Alcian Blue）1 g，使用蒸馏水溶解染料，加酸搅匀。用醋酸溶液来调整pH，过滤*。避光保存。 *使用阿尔新蓝溶液（Alcian Blue） 前一定要过滤 c) 0.1% 核固红 25. 将切片放入3% 醋酸溶液3分钟（用来当媒染剂）。 26. 使用过滤后的阿尔新蓝溶液（Alcian Blue） pH 2.5室温染色30分钟。 27. 使用自来水清洗2分钟。 28. 用蒸馏水冲洗。 29. 使用0.1% 核固红复染2到5分钟。 30. 用自来水冲洗2分钟。 31. 使用二甲苯脱水，清洗 70% 乙醇 - 2分钟 95% 乙醇 - 2分钟×2 100% 乙醇 - 2分钟×2 二甲苯 - 3分钟×2 32. 使用合成永久性封固剂固定切片。这个步骤需在通风柜内完成。固定前，把切片置于二甲苯中。保持湿润。切片上有二甲苯有利于封固剂的固定。 注意：使用不同pH的阿尔新蓝（ Alcian Blue）可检测更酸性或更硫酸化粘蛋白（sulfated mucins）。但若要检测这些蛋白，需使用不同的酸进行溶解。 阿尔新蓝 （Alcian Blue）pH 1.0：使用90 mL的蒸馏水里和10 mL的1N盐酸（hydrochloric acid）溶解1g的阿尔新蓝（Alcian Blue）。 配制1N盐酸：蒸馏水 915 mL，浓盐酸（concentrated hydrochloric acid) 85 mL 阿尔新蓝 （Alcian Blue） pH 0.2：使用100 mL的10% 硫酸（sulphuric acid）溶解把1 g的阿尔新蓝（Alcian Blue） 配制10% 硫酸溶液：蒸馏水 90 mL，浓硫酸 10 mL 当使用强酸染料溶液时，将复染核固红之前的清洗改为排酸并用纸吸干。 隐藏福利 如果您已经看到这里，那恭喜您，解锁了我们的隐藏福利！STEMCELL Technologies与Wiley合作出品了关于类器官研究进展的e-book，内容包括： - 类器官研究中的milestone发表文献总结 - 类器官的来源及分类 - 进行标准化类器官培养的常见问题及解决方案 - 类器官研究的前景展望 点击这里成为第一批读者！ |
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