核糖核酸含量的测定方法-定磷法

A.1 原理

    在酸性条件下，无机磷与钼酸铵结合形成黄色的磷钼酸铵，其反应式为：

    PO₄^3-+3NH₄⁺+12MoO₄^2-+24H^{+   ---}   (NH₄)₃PO₄+12MoO₃·6H₂O+6H₂O

    在还原剂存在的条件下，磷钼酸铵由黄色变成蓝黑色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比。可以通过测定核糖核酸中总磷含量和无机磷含量来确定核糖核酸的含量。核糖核酸中有机磷可经消化转换为无机磷而测定其含量。

 A.2 仪器

A.2.1 恒温干燥箱：控制精度±2℃。

A.2.2 分析天平：精度0.1mg。

A.2.3 离心机：12000r/min。

A.2.4 紫外可见分光光度计：透射比准确度±0.5%。

A.2.5 恒温水浴锅：精度±0.5℃。

A.3 试剂

A.3.1 磷酸盐标准溶液：称取预先在105℃±1℃干燥箱中烘至恒重的磷酸二氢钾（KH₂PO₄，分析纯）0.4389g（精确至0.0001g），于25mL小烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌，至样品完全溶解，将溶液移入100mL容量瓶中，用蒸馏水洗小烧杯数次，将洗液并入容量瓶中，摇匀，以蒸馏水定容至100mL，而成为1mg/mL的含磷标准溶液，使用时再稀释100倍，此稀释液含磷量为10µg/mL。

A.3.2 定磷试剂：将3mol/L 的硫酸，蒸馏水，2.5%钼酸铵，10%的抗坏血酸按1:2:1:1（V/V）的比例配制，配制时，按顺序加，当天配制当天使用，正常颜色呈浅黄绿色。如果呈棕黄色或深绿色，不能使用（注明：2.5%钼酸铵溶解后应呈透明溶液，若为浊状液体不能使用）。

A.3.3 硫酸溶液：3mol/L：量取98%浓硫酸163ml，定容到1000；5mol/L：量取98%浓硫酸272ml，定容到1000ml。

A.3.4 钼酸铵溶液：（25g/ L）：称取25g钼酸铵溶于水中，并稀释到1 L。

A.3.5 抗坏血酸溶液：（100g/ L）：称取100g抗坏血酸溶于水中，并稀释到1 L。

A.3.6 钼酸铵-高氯酸溶液：在193mL的蒸馏水中，加入钼酸铵0.5g，再加入70%高氯酸7mL，摇匀即可。此溶液保存于冰箱，一般可用一个星期。

A.3.7过氧化氢溶液30%（分析纯）。

A.3.8 5%氨水溶液：量取200ml分析纯氨水(25%)，稀释到1000ml。

A.4无机磷标准曲线

取12支干净的硬质玻璃管，按下表加入标准磷溶液、蒸馏水及定磷试剂，平行做两份。将试管内溶液摇匀后，45℃水浴保温25min。冷却至室温后，用1cm的比色皿，于660nm处测定吸光度，取两管平均值，以标准磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，作出标准曲线。试剂加入量应符合表A.1的规定。

表A.1  标准曲线绘制试剂加入量

瓶号	标准磷溶液/mL	水/mL	定磷试剂/mL	相当于无机磷量/μg
1	0	3.0	3.0	0
2	0.2	2.8	3.0	2
3	0.4	2.6	3.0	4
4	0.6	2.4	3.0	6
5	0.8	2.2	3.0	8
6	1.0	2.0	3.0	10

A.5 核糖核酸含量的测定

A.5.1 称取核糖核酸样品0.2g左右（精确至0.1mg）于25mL小烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌，再加入5%氨水溶液1ml，搅拌至样品完全溶解，将溶液移入100mL容量瓶中，用蒸馏水洗小烧杯数次，将洗液并入容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀，以测总磷和无机磷。

A.5.2 吸取以上溶液2mL于50mL比色管中，加入5mol/L硫酸溶液3mL，在恒温干燥箱中150℃加热消化3h,再滴加4滴30%过氧化氢溶液，消化至溶液呈无色透明为止，取下煮沸10min。冷却至室温，加蒸馏水定容至刻度摇匀，待测总磷。同时，另取一支50ml比色管，加入蒸馏水2ml，加入5mol/L硫酸溶液3mL，相同条件下处理，冷却、定容，做空白用。

A.5.3 取一支10mL离心管，吸取样品2mL，加钼酸铵-高氯酸溶液8mL，放置于4℃冰箱中30min后取出离心，待测无机磷。

A.5.4 磷含量检测

A.5.4.1 测总磷：

取10mL试管两支，一支作为空白，加蒸馏水1mL， A.5.2所制备的总磷空白样2ml，定磷试剂3mL；另一支加蒸馏水1mL，  A.5.2所制备的总磷液2mL，定磷试剂3mL。两支试管摇匀后，一起置于45℃水浴加热25min，取出冷却至室温，用1cm的比色皿在紫外可见分光光度计上，测定660nm处的吸光度，根据测得的吸光度值于标准曲线上查得相应的微克数A。

A.5.4.2 测无机磷：

取10mL试管两支，一支作为空白，加蒸馏水3mL，定磷试剂3mL；另一支加蒸馏水1mL，A.5.3所制备的无机磷上层清液2mL，定磷试剂3mL。两支试管摇匀后，一起置于45℃水浴加热25min，取出冷却至室温，用1cm的比色皿在紫外可见分光光度计上，测定660nm处的吸光度，根据测得的吸光度值于标准曲线上查得相应的微克数B 。

A.6 计算

核糖核酸含量按公式（A.1）、（A.2）、（A.3）计算:

式中：

X₁——样品的水分， %；

X₃——样品中总磷的量， %；

X₄——样品中无机磷的量， %；

X₅——样品中核糖核酸含量， %；

A——标准曲线查得总磷的量，单位为（μg）；

B——标准曲线查得无机磷的量，单位为（μg）；

m——样品的质量，单位为（g）；

1250——被测总磷液的稀释倍数；

250——被测无机磷的稀释倍数；

10⁶——克与微克的换算关系；

340——四种核苷酸的平均分子量；

31——磷的原子量。