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昨天发布的文章刷屏之后，今天继续解读来自Nature的m6A最新进展。真核细胞内存在大量转录后修饰对RNA的剪切、拼接、翻译效果以及稳定性产生不同影响。其中m6A(N6-methyladenosine) 是mRNA中最普遍的转录后修饰，属于RNA甲基化的一种，一般情况下25%的mRNA存在m6A修饰，对免疫、生物代谢、细胞分化等细胞生理过程起重要作用。然而细胞内部环境复杂，不同mRNA中的m6A修饰、不同的细胞环境下的m6A调控机制与生物学功能和规律有待深入探索。 2019年7月10日，Cornell University的Samie R. Jaffrey团队在Nature正刊上发表了题为m6A enhances the phase separation potential of mRNA的重要文章，发现了m6A修饰的mRNA显著增强了细胞溶质m6A结合蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的相分离作用。 基础研究背景 1. m6A：(N6-methyladenosine，N6-甲基腺嘌呤），是最常见的一种转录后修饰，介导了超过80%的RNA甲基化。其调控机制与生物学功能涉及到癌症发生和转移、胚胎发育、脂类代谢、环状RNA翻译和DNA损伤修复等，是表观遗传学的研究热点。 2. YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3：是经典的m6A结合蛋白（以下分别为DF1、DF2和DF3），具有高序列同源性，包括一个约15 kDa的YTH结构域(结合m6A)和一个约40 kDa类似脘病毒的结构域，是研究m6A的重要工具。 3. phase separation：相分离，主要是液-液相分离(liquid–liquid phase separation) 是细胞质内维持代谢稳定的重要手段。相分离的产生可在细胞内形成独立的小环境，使其中的生物学反应免受其它代谢的影响，是细胞质复杂代谢途径有条不紊的关键。细胞质内有哪些相分离、具体相分离的结构和形成机制还存在许多未知，是近年来细胞生物学的研究热点。 为了探索m6A如何影响mRNA的后修饰，研究人员对DF1、DF2和DF3进行分析，揭示其具体调控机制。通过蛋白序列分析发现3种DF除了与m6A结合的YTH结构域以外，还存在一段约40kDa朊病毒样的肽段(prion-like domains)，并推测该结构可能会诱导液-液相分离（liquid–liquid phase separation ，LLPS）。对此，作者对细胞内含量最高的DF蛋白DF2进行纯化，在体外实验中发现发现多m6A修饰的mRNA可触发纯化DF蛋白的液相液相分离。如下图所示：DF2的试管从4℃加热至37℃，加热时DF2发生可逆的液-液相分离，通过延时显微镜图像可见清晰的DF2液滴，而 温度从22℃提高到37℃，使蛋白质滴的形成，温度降低到22℃液滴的逐渐解体。同时NaCl抑制DF2相分离液滴。另外发现含有10个m6A核苷酸的RNA在几分钟内就触发了LLPS。这可能DF蛋白的Pro-Xn-Gly基序相关。  a图：将含和不含DF2的试管从4℃加热至37℃，加热时DF2发生可逆的液-液相分离；b图：通过延时显微镜图像可见清晰的DF2液滴(75μM), 温度从22℃提高到37℃，使蛋白质滴的形成，温度降低到22℃液滴的逐渐解体；c图：NaCl抑制DF2相分离液滴 ；d-e图：荧光显微镜下，相分离液滴融合；f图：不同m6A修饰量的65nt mRNA对DF2相分离液滴的促进作用；g图：含有10个m6A位点mRNA对不同DF的影响。 过去的研究报道DF蛋白主要被定位于神经元RNA颗粒、p体和应激颗粒，是胞质中3种不同的相分离的小室。是m6A mRNA的定位的研究线索，为了进一步确定DF蛋白在细胞质中是否发生相分离，作者对利用CRISPR-Cas9将NeonGreen插入DF2基因座，内源性DF2带上NeonGreen标签 (NeonGreen-DF2)。发现，细胞处于在非应激条件下，DF2主要位于p体，而热休克条件刺激条件下，如下图所示p体中的DF2转移至应激颗粒内外，且发现应激颗粒外的NeonGree-DF2呈现浓缩聚集类似微小的相分离形态。  但考虑到压力有促进mRNA中m6A水平的可能性，如热休克和暴露于亚砷酸盐可导致mRNA甲基化增加。为进一步确认上述相分离现象是否有m6A参与调控，研究人员在小鼠胚胎干细胞（mES）中敲除m6A形成所必须的METTL14基因。结果显示， Mettl14-knockout细胞内热休克条件下Stress Granule在热休克后能正常形成，而DF2在其中的定位显著减少，其WT中DF2可聚合成球状颗粒，而Mettl14-knockout细胞内无法形成该结构（图a）。同样，不结合m6A的DF2突变体显示，热休克条件后，突变株内无法形成聚集的NF2液液相分离颗粒(图c)。可以证明，DF2必须与m6A-mRNA结合，才能有效地形成颗粒。此外，利用p -体标记物EDC4在野生型和mettl14敲除mES细胞中容易检测到p -体(图d)。然而，在mettl14敲除细胞中，DF2呈弥漫性胞浆性，没有明显的p体富集(图d)。证明m6A-mRNA同时拥有将DF2定位于p体的作用。  图a:WT和METTL14敲除的mES细胞在热休克下NF2分布和形态； 图b：野生型和mettl14敲除mES细胞中DF2荧光强度；图c：WT和DF2-突变型在应激条件前后DF2聚集情况；图d: WT和METTL14敲除mES细胞中DF2与p -体（EDC4标记）定位分布情况。 基于上述结果，作者得出结论多m6A修饰的RNA调控DF2的相分离和并参与其细胞定位的调控，同时。作者推论DF-m6A-mRNA复合物又可能够反过来调控带m6A修饰的RNA的翻译效率和mRNA稳定性从而影响相关基因的表达。作者还讨论到DF m6A-mRNA复合物相分离在细胞内特异性分布和每个mRNA中的m6A位点的数量对不同疾病、细胞分化和信号转导下做精准调控的可能性，为m6A甲基化修饰对表观遗传学、细胞生物学提供了新的观点。 |
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