Nature | 庄小威组再添单分子成像新工具：DNA旋转过程全记录

基因组被转录、复制以及修复的过程中都涉及到DNA的旋转。但是如何去测量和记录DNA在如上过程中旋转的角度、时间以及路径呢？目前探测DNA旋转方面已有一些方法，比如转珠记录【1-3】、角度光学捕获【4】以及磁镊【5】等等以观测如RNA聚合酶【6】、解旋酶【2】、DNA重组酶【7】等过程中出现的DNA旋转现象。2001年发表在Nature上的一篇文章首次通过光学显微镜实时记录了DNA在转录过程中的旋转【6】。该文章将荧光标记的磁珠与DNA相连，在大肠杆菌RNA聚合酶转录时，通过记录磁珠荧光实时旋转的情况作为DNA旋转的图像（图1）。

图1 首次实时记录DNA旋转的工作系统模式图（上）与光学显微镜中旋转着的荧光标记的小珠的快照图【6】

类似于转珠记录等方法为探索DNA旋转过程迈出了成功的第一步。但是，想要详细地记录DNA旋转过程并且排除额外添加作用力的情况下进行测量并不容易，尤其是如何弥补现有测量方法中时间分辨率不高的缺陷。

为了解决该问题，2019年7月18日，哈佛大学的庄小威研究组在单分子成像方面再次取得重要进展，于Nature上发文Rotation tracking of genome-processing enzymes using DNA origami rotors，为在修复以及转录等过程中涉及DNA旋转现象提供了新颖且有效的测量方式。

庄小威研究组建立了名为基于可折叠DNA（DNA折纸）转子的成像追踪技术（Origami-rotor-based imaging and tracking, ORBIT)，使用荧光标记的DNA转子在单分子水平上追踪毫秒级别的DNA旋转过程（图2）。

图2 ORBIT系统示意图。以荧光标记DNA折纸转子，从而记录和放大粘附在玻片上的马达蛋白引起的DNA旋转过程

什么是DNA折纸技术？在2006年Paul W. K. Rothemund建立了一种将长的单链DNA折叠成为任意二维形状的方法，以长单链DNA作为支架，短的核苷酸链作为填充，混合之后可以形成所设定的特殊形状（图3）【8】。随后又发展出能够建立三维结构的DNA折纸技术【9】。庄小威研究组的DNA旋转记录系统正是基于该DNA折叠技术。

图3 DNA折纸技术构建不同的形状的DNA图案【8】

为了验证ORBIT技术对于DNA旋转过程的测量是否准确，作者们使用常见于DNA修复过程中的解旋酶RecBCD复合体【10】在DNA修复过程以及RNA聚合酶在转录过程中引起的DNA旋转现象进行测量。作者们使用的DNA折纸转子包括四个叶片，每个叶片垂直于旋转轴延伸80nm。双链DNA片段沿着旋转轴从转子中心延伸用DNA相互作用酶的底物（图2）。80nm的DNA长度既能够在DNA旋转过程中放大DNA的动作，又能够最大程度的降低流体阻力和扭转刚度，因而保证了该记录系统高度的时空分辨率。

作者们荧光标记了DNA折纸转子其中一个叶片的尖端，通过原子力显微镜记录可以发现，DNA折纸转子的组装是成功的且成功率很高，并可以将RecBCD复合体引起的DNA旋转过程的路径进行记录（图4）。

图4 ORBIT实验系统的组装情况以及DNA旋转路径记录

为了进一步证明ORBIT实验系统运用的广泛性，作者们尝试希望通过ORBIT系统记录转录过程中RNA聚合酶引起的DNA旋转。结果显示RNA聚合酶引起的DNA旋转对应于DNA单碱基对的逐渐易位，表明RNA聚合酶引起的DNA旋转运动与单个碱基的DNA螺旋之间的紧密耦合。

总的来说，庄小威研究组开发的ORBIT方法可以用于在极高的时空分辨率和高通量的情况下追踪单分子旋转，并进一步证明了DNA纳米技术在研究生物大分子运动方面所展现的巨大潜力。由于DNA折纸转子的结构特性可以由研究者自由决定，因此，ORBIT在DNA旋转测量和酶动力学等方面的研究将具有广泛的前景。

原文链接：

https://www./articles/s41586-019-1397-7

参考文献

1    Bryant, Z. et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature 424, 338-341, doi:10.1038/nature01810 (2003).

2    Gore, J. et al. Mechanochemical analysis of DNA gyrase using rotor bead tracking. Nature 439, 100-104, doi:10.1038/nature04319 (2006).

3    Lebel, P., Basu, A., Oberstrass, F. C., Tretter, E. M. & Bryant, Z. Gold rotor bead tracking for high-speed measurements of DNA twist, torque and extension. Nature methods 11, 456-462, doi:10.1038/nmeth.2854 (2014).

4    Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S. & Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods 4, 223-225, doi:10.1038/nmeth1013 (2007).

5    Lipfert, J., van Oene, M. M., Lee, M., Pedaci, F. & Dekker, N. H. Torque spectroscopy for the study of rotary motion in biological systems. Chemical reviews 115, 1449-1474, doi:10.1021/cr500119k (2015).

6    Harada, Y. et al. Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Nature 409, 113-115, doi:10.1038/35051126 (2001).

7    Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F. & Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications 2, 439, doi:10.1038/ncomms1450 (2011).

8    Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature 440, 297-302, doi:10.1038/nature04586 (2006).

9    Douglas, S. M. et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature 459, 414-418, doi:10.1038/nature08016 (2009).

10    Dillingham, M. S. & Kowalczykowski, S. C. RecBCD enzyme and the repair of double-stranded DNA breaks. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 72, 642-671, Table of Contents, doi:10.1128/MMBR.00020-08 (2008)