如何研究自噬Part2：自噬的“黄金标准” 及调控自噬流的方法

上期我们学习了自噬的概念及自噬的切入角度。在明白如何切入自噬研究方向之后，我们还需要知晓有哪些“标准”能够提示自噬的发生。也即如何衡量研究对象系统内（比如药物或者基因干预细胞系、原代细胞，甚至动物个体组织和脏器）是否发生了自噬、以及自噬流的强弱变化。

这些“标准”无论是对基金的申请、论文的发表还是课题研究都十分的重要，因为这些“标准”是国际上自噬研究领域的专家们一致性的观点。在此，我们姑且称之为自噬研究的 “黄金标准”（图1）。

这些“黄金标准”包括LC3剪切的变化、电镜直接观察到自噬囊泡、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流。LC3剪切和和电镜相对比较简单，下面我们会有详细内容讨论如何利用荧光蛋白探针研究自噬流的变化。

图1，衡量自噬的三个“黄金标准”，分别是LC3的翻译后加工及脂化修饰、利用电镜直接观察自噬小体和自噬溶酶体的多少、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流。

调控自噬流的两种常见方法

如果需要考察自噬是否参与某个表型，首先我们可以通过改变自噬的强弱来观测与表型强弱之间的正向或者反向关系，以此初步判断自噬与表型的相关性。在此我们着重介绍两种操控自噬的方法：

①自噬的诱导：利用饥饿培养条件（如EBSS饥饿培养基，不含有血清和氨基酸）来激活自噬流。EBSS配方如下：

                                               

过滤除菌，4°C可以保存2周。EBSS处理细胞超过16hr可以有效的激活自噬。类似的还有用mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）及其类似物处理细胞，在1-20 mM的浓度下处理2hr就可以有效诱导自噬。以上两种诱导条件会显著增加自噬囊泡的数量。

②抑制自噬流： 最常使用的抑制剂是溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine diphosphate），通常使用浓度在30-100 mM，处理时间为12-16hr。氯喹处理过的细胞由于溶酶体功能被抑制无法正常降解底物，这会致使自噬流由于阻断而变相增强。类似抑制晚期自噬进程药物还有Bafilmycin A1、NH4Cl以及溶酶体蛋白酶抑制剂Leupeptin A、E64d、pepstatin A等，均可以抑制溶酶体对底物的降解，显著增加自噬囊泡的数量。

需要说明的是，3-MA也属于常用自噬抑制药物，但其抑制的是自噬发生的较早期，会显著抑制自噬小体的形成（各抑制剂的靶点请参考（图2））。

图2，自噬流的基本过程。自噬流的发生需要多种蛋白质因子参与的一个复杂过程，其中很多步骤可以通过基因操作或者药物人为干预。