siRNA干扰实验流程

前言

在研究某基因的功能时，常常要用到某基因的过表达，或敲除，或敲低这些实验方法。

在敲除方面，常用的就是Crispir/Cas9技术，不过此技术周期比较长，步骤比较麻烦，就我们实验室而言，做的熟练的同学，最快也得需要一个月。如果临时想要研究某基因的功能，例如某个miRNA的靶基因，想要敲低这个靶基因，通常会采用siRNA的方法，这种方法速度比较快，从下订单到实验结束，最快需要两周（公司合成通常是一到两周），但成本略高，这里总结一下siRNA的实验方法。

转染siRNA有很多方法，有国内公司的转染试剂（例如锐博），也有常规进口的，例如Lipo2000或Lipo3000，这里只介绍一下QIAGEN的HiPerFect（因为我觉得这种最方便）。

试剂

HiPerFect转染试剂（QIAGEN，货号：301705）
OPTI-MEM（ThermoFisher，货号：31985-062）
siRNA（干粉，广州锐博）

试剂配置

siRNA的订制

siRNA是一段寡核苷酸片段，直接向公司订制即可，周期通常是1到2周。以锐博公司为例，从公司订回来的siRNA通常包括5条，1条装一管，分别是目的基因的3个（公司会保证至少有1条能敲除目的基因，使用之前最好验证一下），1条是针对Actin的，这是阳性对照，一条是Negative Control（NC），阴性对照。

siRNA的分装

收到的siRNA试剂通常是干粉装的，一管含量通常是5nmol，使用之前需要配置为20μM的储备液，那么5nmol需要加无菌水250μL。配置结束后，需要分装，为了避免反复冻融，通常是分装到200μL的EP管中，每管装10μL或5μL，使用的时候，拿出适当的剂量即可。

例如我要转染的细胞是铺在6孔板中，siRNA的终浓度是50nM，那么1个孔中就需要加5μL的siRNA储备液，此时拿出一管目标siRNA与一管阴性对照（NC）即可。

在使用之前，需要对siRNA效果进行验证，因为3条siRNA链中有可能其中1条或2条不会敲低目的基因，验证过后，选择那条能敲低的siRNA即可。如果实在不想验证，那么在使用之前，分别各取1管分装好的siRNA，将这3条siRNA储备液混合起来，吸取5μL加入到6孔板中即可（但也要验证，只是这种情况下只需要验证混合的效果即可）。

实验流程

这里以转染RAW264.7细胞为便说明一下，以下实验步骤均参考自QIAGEN的说明书，并且本人已经进行了验证。

1. 提前一天将RAW264.7细胞铺在6孔板中，细胞数目为2.5x105个/孔（每孔25000个细胞），培养基总体积为2300uL。

2. 次日，取将20μM的siRNA储备液（如果转染的是miRNA mimics，也是如此）5uL加到83uL的不含血清的培养基中（OPTI-MEM培养基）。5μL的siRNA加到6孔板的1个孔时，孔中的终浓度是50nM，随后在上述混合液中加入12uL的HiPerFect转染试剂（QIAGEN官网参考资料中推荐了不同的浓度，一份是说加6uL，一份是说加12uL，这里加12uL），混匀即可，此时总体积为100uL。

3. 在常温下孵育5到10min。

4. 将上述的转染复合物逐滴加到6孔板中，轻轻混匀。

5. 将细胞培养板放到孵箱中，在48到72小时后检测基因表达量。

6. 检测编码基因的敲低效果时，就是采用Westenl Blot，这个是金标准（文章中也会要求提供WB的数据），毕竟最终目标是蛋白，这里不建议采用RT-qPCR的方式检测敲低效率，因为有的时候mRNA变化并不明显，但蛋白水平会明显降低（除非转染的是miRNA或lncRNA的siRNA这些非编码核酸，只能RT-qPCR方式进行检测）。

   注：《HiPerFect Transfection Reagent Handbook》中提到，在24孔板中转染RAW264.7时，流程跟上面有所出入，先是细胞用100uL的培养基加到24孔板中，再加siRNA，再加HiPerFect，放到孵箱中孵育，6小时后，再补充400uL的培养基，这种方式没有验证过，不推荐。

参考资料

1. Quick-Start Protocol HiPerFect®Transfection Reagent

2. Fast-Forward Transfection of RAW 264.7 cells with miRNA/miRNA inhibitor using HiPerFect Transfection Reagent

3. HiPerFect Transfection Reagent Handbook