科研干货 | RNA-seq临床应用——分析子宫内膜癌患者血清EVs中circRNA的表达

 1月24日

导读

RNA-seq是一种集合实验方法与计算手段的生物技术，它可以确定生物样本中RNA序列的特征性和丰度，也就是说，存在于每条单链RNA分子中的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核糖核苷酸残基的组成顺序，可以通过RNA测序被识别出来。同早期的技术方法相比，目前的RNA-seq平台惊人的高通量性和高灵敏度，能够使我们发现新的转录本、基因调控模型和更多非编码小RNA。RNA-seq数据可以让我们知道很多未知的东西，比如我们可以识别出胚胎干细胞中编码新蛋白质的转录本，可以找到皮肤癌细胞中那些过表达的转录本。本期小编就跟大家分享一篇RNA-seq应用于临床分析宫颈癌患者血清EVs中circRNA表达的研究案例。

Circular RNA expression in extracellular vesicles isolated from serum of patients with endometrial cancer

研究背景

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，每年有接近20万的新发病例，死亡率仅次于卵巢癌和宫颈癌。

细胞外囊泡（EVs）在细胞通讯中起重要作用。EV是脂质双层颗粒将携带的蛋白质、生物活性脂质和核酸运送至靶细胞，从而影响靶细胞的行为。EVs中含有多种核酸成分，其中包括mRNA、miRNA、长非编码RNA以及circRNAs 等。肿瘤来源的EVs可以作为生物标志物来预测转移倾向并确定未来转移的器官部位。在许多研究中已经发现正常个体与癌症患者的EV之间的差异，其中最显著的是miRNA等释放速率和含量增加且不同。在该案例中，研究者分析正常个体与子宫内膜癌患者EV之间的差异，希望可以找到新的生物标志物来预测癌症的发展、转移和预后。

环状RNA（circular RNAs，circRNAs），广泛存在于人和动植物中，是一类新的隐秘未知但却功能异常强大的非编码RNA。不同于线性RNA，circRNAs呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。这种特性，预示circRNAs有巨大潜力成为新的临床诊断标志物。最近研究证实，circRNAs是ceRNA调控网络中的重要成员，可以像“海绵”一样大量吸附miRNAs，进而调控基因表达。 目前研究EVs中circRNA在致癌性中的作用越来越多。首先，富含循环肿瘤EVs的circRNA可作为癌症诊断的生物标志物。其次，研究它们对局部和远端受体细胞的影响可能有助于鉴定新的癌症发展机制。该研究则使用RNA-seq技术分析从子宫内膜癌患者和健康对照的血清中分离的EVs中的circRNA表达，并使用生物信息学方法探索这些circRNA在子宫内膜癌中的作用。

研究结果

1. 胞外囊泡大小的分布
    该研究从3名50-60岁III期子宫内膜癌患者和3名健康受试者的血清样品中分离提取EV。使用激光散射显微镜检测EV浓度和大小。 结果显示，子宫内膜癌患者组EV浓度为6.2±0.8×1011 / ml，平均直径为111.3±4.2nm，健康对照组为2.6±0.5×1011 / ml，平均直径为114.1±3.7nm。并在图1中展示了直径为50-300nm的EVs尺寸分布。

Figure 1. Representative picture of distribution of size of extracellular vesicles.

(A) Controls. (B) Cases.

2. 鉴定差异表达的circRNA

    研究者还从EVs中提取RNA并使用RNA-seq技术进行分析。去除具有零读数的基因后，获得15248个circRNA。这些circRNA的长度密度如图2A所示。将原始读数计数归一化并使用DESeq2过滤差异表达的circRNA。得到275个环状RNA，包括209个上调的circRNA和66个下调的circRNA（图2B和C）。

Figure 2. Characteristics of circular RNAs in extracellular vesicles froum of patients with endometrial cancer and healthy controls. (A) Density of spliced length of the detected circRNAs. (B) Heatmap analysis of differentially expressed circRNAs with a p-value < 0.05(n = 6). Each row represents the expression level of a circRNA and each column represents a serum sample. Pseudo-colors indicate expression levels from low to high (green to red). (C) Circos diagram illustrating the fold-change of differentially expressed circRNAs with a p-value < 0.05 (n = 6). Red indicates upregulated genes, and blue indicates downregulated genes. The height of the bar represents the fold-change of a circRNA. circRNA: Circular RNA.

3. 涉及途径的分析

    用差异表达的circRNA基因符号表进行KEGG途径富集分析。 在275个差异表达的circRNA中12个circRNA在5个途径中富集（图3）。我们注意到FN1和ACTN4与最大数目的途径相互作用，表明这两个基因可能比其他基因发挥更重要的作用。而且已有研究证明，局部粘附、细胞外基质（ECM）-受体相互作用和肌动蛋白细胞骨架调节的富集途径与癌症的迁移和侵袭相关。

Figure 3. Network of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways and circular RNA gene symbols.

circRNA: Circular RNA; Green circle: Downregulated circRNA; Red circle: Upregulated circRNA.

4.验证circRNA的表达

    在分析结果中大多数circRNA的倍数变化低于2。其中两个circRNAs，hsa circ 0109046和hsa circ 0002577，倍数变化高于2，在子宫内膜癌患者中表达上调。研究者使用实时定量PCR（RT-qPCR）验证了这两个circRNA的表达。结果显示hsa circ 0109046（图4A）和hsa circ 0002577（图4B）的表达水平在子宫内膜癌患者血清EV中高于来自健康对照者EVs中的水平。

Figure 4 RT-qPCR validation of the expression level of hsa circ 0109046 and hsa circ 0002577 in ten patients with endometrial cancer and ten healthy controls. (A) hsa circ 0109046 (n = 20; p = 0.01). (B) hsa circ 0002577 (n = 20; p < 0.01).RT-qPCR: Real-time quantitative PCR..

5. 预测circRNA / miRNA相互作用

    研究者保存了hsa circ 0109046和hsa circ 0002577 FASTA格式的序列。然后使用miRanda和RNAhybrid软件预测circRNA / miRNA相互作用。仅考虑两种软件预测的circRNA / miRNA相互作用。图5显示了两种circRNA和miRNA之间可能存在的功能网络。

Figure 5. Networks of circular RNA/miRNA interactions predicted using miRanda and RNAhybrid software.  

研究结论

本文为了探索子宫内膜癌患者血清中分离的细胞外囊泡（EVs）中环状RNA（circRNAs）的作用。从3名50-60岁患有III期子宫内膜腺癌的患者和3名健康受试者的血清样品中分离EV，从EV中提取RNA并使用RNA-seq技术进行分析，鉴定出209个上调的circRNAs和66个下调的circRNAs。经过KEGG富集分析发现差异表达的circRNAs主要集中在5种途径。使用RT-qPCR确认hsacirc 0109046和hsa circ 0002577两种circRNA的表达，还预测了这两种circRNA的circRNA / miRNA相互作用，这将有助于人们揭示癌症侵袭和转移的潜在机制。此外，EV中稳定的circRNAs可提供一种新型生物标志物，用于预测子宫内膜癌的发生、转移和预后。

文章链接：

https://www./doi/full/10.2217/epi-2017-0109?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org&rfr_dat=cr_pub%3Dpubmed