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Circular RNA (circRNA)自大约1979年被发现，之后的30年里几乎无人问津，直到近几年出现了爆发性的研究增长，研究热点也已从开始的大规模筛选鉴定逐渐转向特定基因的功能和机制研究。 除了CDR1as(ciRS-7)和circ-FOXO3等少数几个基因有多篇文章报道其功能和作用机制外，大量cricRNAs的功能研究还是空白，这其中过表达（功能获得性研究，gain of function）自是避不开的重中之重。不同于mRNA，circRNA由于其形成的复杂性和表达的多态性，对其过表达有更大的难度，大部分同学也都碰到了各种各样的问题。 综合文章和其他人的反馈来看，circRNA过表达主要三个难点： 湖人今天就为大家支几招，介绍具体怎么构建circRNA的过表达载体，明天还将介绍怎么严谨地验证是否过表达成功。 第一招：拿来主义 “你能想到的，别人早都想到了，而且还发了文章。”研究生几年里听到最多的大概就是这句话了，每每兴奋有个奇思妙想，最后总是碰一鼻子灰，毕竟研究既要novel又要有mechanism可一点都不容易，这时候拿来主义就显得比较有用了。我做不好，总有人做的专业呀！ 目前国内能提供circRNA过表达业务的公司很多，都有现成的方案和空载体，直接拿来用就行了。这里我以自己用过的某公司产品pLCDH-ciR举例，据介绍该载体基于模拟内源性的环化模式开发，由两个通用的成环框架介导环化和剪切，框架序列包括一段反向重复（Alu）序列和一段效应QKI蛋白的序列，以及一段人工修改的剪切介导序列，整体框架可使插入的环状RNA序列高效率环化，并精确地在AG-GT位点严格剪切。应该就是和内源的侧翼Alu序列介导环化一个原理，不过特殊设计了序列，以使对不同的插入序列都能介导环化，并且可以准确剪切，逻辑思路还是很清晰的。
该载体使用需要先扩增目的circRNA序列，在5’和3’端加上一段介导序列（听说可以调控准确剪切）和两个酶切位点EcoRI/BamHI，然后做酶切连接。这和其他载体构建是一样的流程，几天就可以构建完成，还是很简便的，重点是通用性高，随便挑个基因都可以这样做，很适合同时做多个基因，拿来用之，省时省力呀！ 第二招：他山之石 读文献，读文献，读文献，重要的事情说三遍。这里要介绍的第二招就是看文章来的，在Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production（Genes Dev. 2014;28:2233–2247）这篇文章里，作者分析了circ-ZKSCAN1的侧翼序列和Alu元件，首先克隆ZKSCAN1的exon2/3和侧翼序列共2232bp来构建载体，成功过表达了circ-ZKSCAN1。接着对侧翼序列具体分析，一段一段地删除序列再检测基因过表达情况，以得到真正决定成环的侧翼序列区，最终保留5’端侧翼序列87bp，3’端侧翼序列59bp，并将ZKSCAN1的exon2/3替换成一段多克隆酶切位点，构建了一个空载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector。 pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector示意图：
该载体使用也是以酶切位点连接目的circRNA序列，但可能由于侧翼的成环序列比较短，介导成环能力有限。我做过的几个基因过表达倍数普遍不高，还有错误成环，把框架序列也加到成环产物里了的，这样的恐怕不能往下做。想使用这个载体的同学，建议去掉酶切位点，直接把成环序列加到你circRNA的两端，这样应该可以保证成环准确。 第三招：回本溯源 前面两招都是使用通用的载体，其成环序列是模拟和替换内源性的模式，这里第三招回本溯源就要介绍使用基因天然的侧翼序列构建载体了。很明显几乎所有circRNA成环都和本身的侧翼序列直接相关，那我们把基因和其本身的侧翼序列一起克隆出来，放到载体上自然也应该可以过表达。 对于侧翼序列的选择，最理想的情况是上下游1kb内都有明显的重复元件（Alu），克隆到的侧翼序列含两个或以上重复元件分布在circRNA的上下游，可以促使成环和剪切，这和体内天然的形成模式是一致的。
这里的has_circ_0007874由两个外显子组成，长度318bp，我向上下游各延伸1kb，在Repeat Element处可以看到都有明显的重复元件，下一步导出序列，只截取上下游各延长550bp即可，过长的序列可能导致克隆难度增加，这里550bp内有重复元件，肯定够用了。序列里下划线标记的就是延伸的侧翼序列，其中小写代表重复元件，红色标记的AG-GT是剪切位点。可以PCR法或基因合成克隆这一段1418bp序列到载体上（如pcDNA3.1）就可以过表达has_circ_0007874了。
PS：此处仅以has_circ_0007874为例说明分析和确定侧翼成环序列的思路，我自己没有实际做过这个基因。 第四招：移花接木 前面讲了先模拟再通用，又介绍了基因特异的成环方案，这里第四招移花接木要介绍将基因特异的成环方案换成一个通用的方案。对于cricRNA过表达，总是依赖侧翼序列促使成环来得方便，那我们是否可以将has_circ_0007874的侧翼序列拿去过表达其他基因呢？答案是肯定的。 具体做法也简单粗暴，把第三招里的全长序列复制下来，接着把内部AG-GT之间的has_circ_0007874序列换成你要研究的circRNA，也即替换中间的NNNN，然后构建载体，就可以成功过表达啦。
第五招：无招胜有招 前面四招我相信基本可以覆盖所有circRNA了，一招不成功就换另一招。可能还有些同学饱受deadline的摧残，赶时间毕业或评职称，特别一些学临床的没有条件和资源做实验，给你们的第五招就是请外援，找公司！毕竟我们讲专业的事交给专业的人做，你没时间做，没实验条件，或者总是做不成功的，都可以尝试找公司做。我自己有接触过一两家，还是很靠谱的，需要做的就是提供基因信息，然后等结果，看似无招实则胜过所有招数啊。 好了，上面的五种招数应该够用，湖人也祝所有同学都可以成功。明天我将继续讲解怎么严谨地验证是否过表达成功，我们江湖再见！ |
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