启动子实验，从序列到质粒，手把手教程。

果子荐读

又到了每周二豆子老师的实验专栏，一晃眼这都到了第27期了。
但这仅仅是豆子老师技能的一小部分，对于一个长期做实验，而且还奋斗在一线的人来说，还可以再讲三天三夜。

四年前的时候，有培训机构跟我说，我们招老师的标准很简单，就是能够就自己所教的主题进行15个小时以上的教学。这真的是一条排他性很猛的标准，不容易满足。很幸运，我们两个实验专栏的作者都能满足。

今天的内容，是个很好的能够阐明公众号愿景的例子，假如你正在为某个技能烦恼，灰心失意，这样的帖子会带来一点希望，缓解不少焦虑。他会让你知道，你目之所及，耳能听闻的周围，有人会这个技能，你不再孤独。

以下是正文

第一次关注某个电影的评论，虽然也知道是瞎操心没什么用，就是忍不住希望他是最厉害的，但是现实总是会很好的打破你的希望，让你无力反驳，即使这样的结果现在却也能很淡定的接受。突然觉得人总是越长大，越能很好的接受现实，小时望月，手可摘星，大即望天，遥不可及。。。

之前我们已经探讨过如何来设计启动子的引物，现在我们就实例操作一下，让大家有更直观的感觉。

1.找到启动子

以ERb为例，首先我们按照之前的方法找到ERb的启动子区域，我们可以看到，总共是从64293910-64299410的5501bp。
转录调控的研究，第一步是获得启动子

2.选择载体

接着选择我们的载体，为什么会选择这个载体，我们之前也聊过，我就不赘述了
转录调控的神器：荧光素酶报告基因实验

3.选择酶切位点：

然后把我们的序列复制到http://nc2./NEBcutter2/
中，出现如下结果

紫色出现的就是目的片段中出现的酶切位点，也可以看到总共为5501bp，因为我们所需要的片段只会比这个短，所以这里面不包含的酶切位点就肯定不会出现在比这个短的片段中。我们选择的酶切位点就是片段中没有而载体中存在的，同时尽量避免选容易甲基化的酶，因为我们切成不同长度的片段，一般都会用同样的酶切，还要避免同尾酶，这个在最后设计完一定要检查一下。通过对比，我们找到Nhe I和Hind III，Nhe I是XbaI的同尾酶，而Hind III不是Nhe I的同尾酶，也不容易甲基化，所以选定二者为我们的酶切位点接着向下走。

4.增加保护碱基

可以看到切割率和保护碱基，所以上游引物的酶切位点和保护碱基就为CTAGCTAGC，下游引物的酶切位点和保护碱基就为CCCAAGCTT，那么接下来我们就可以设计引物。

5.引物设计

因为oligo7很方便全面，所以就直接选择的Oligo 7。打开软件按之前的方法将我们的目标序列拷进去，

接着来设计引物，方法同前，点击Ranges，需要将PCR长度改成最大为5501个，同时上下游引物的范围都从1到5501，最短为什么选40是因为如果你想P的片段是在40以内，不如直接合成。

我们一般设计启动子引物，会将一端先固定，另一端逐渐删减，然后再在最小的范围内不断的设计不同的片段从而得到具有启动子活性的小片段，通过看荧光素酶活性来反应启动子的活性，这并不是一次设计就可以把启动子片段筛选出来的，刚开始只能大概设计一个范围，然后需要通过做实验不停的筛选，第一次设计可以先固定3’端+400多，然后设计一个最长的5000左右，再3000左右，2000左右，1000左右，700左右，500左右，300左右，比如我们首先选择固定ERb的+436的位点，

我们就可以点击最上面一排的Reverse Primer，这时候他就会按照从左到右的位点来排列，5436就代表我们输入的第5436个碱基，就相当于我们认为的+436，这里可能需要稍微绕一下弯，5000以前的就是我们之前的负值，而5000之后的相当于正值。就比如第496个引物（编号在最左边），如果我们准备要他，那就双击他，就会出现引物的一些基本信息，然后再参照之前的教程把引物全部检测一遍

感觉还可以，那么就输出上下游引物序列，5’ TGCCGCCATTTCTAACAGTCC 3’ 和5’ AACACGACTGGTTTCTCACCG 3’各自加上我们的酶切位点和保护碱基即我们设计的引物，即上游引物5’ CTAGCTAGCTGCCGCCATTTCTAACAGTCC 3’，下游引物为5’ CCCAAGCTTAACACGACTGGTTTCTCACCG 3’

其他的都可以可以按照之前的步骤做一遍，之前我们也说过，我们需要固定一端，另一端进行删减，所以第一次设计引物的时候，可以先初筛一下，可以看到从序号473到496都是固定在+436，另一端在变化，还有不同的长度，这个时候不需要全部选择，按照我们之前说的选择几个范围就可以，比如474，475，477，478，480，482，485，488，490，496，然后定了范围，再固定另一端，比如另一端固定在位点4655，只需要点击Forward primer就可以出现，固定在4655，另一端不同的引物。

如果你想要选择片段的引物没有自动显示，那也不要紧，你可以直接在oligo上去找，比如你想要的是4805-5129，那你可以在下图中直接挪到4805，然后点击带绿框的Forward Primer，你就会发现会固定在4805这个地方，5129也是同理，框下面的PCR Product就可以看到基本信息。

我们在P启动子的时候往往不会向QPCR那么严格不能有非特异性的条带，我们的要求是只要出现目的长度的片段即可，所以引物设计没那么严格，那为什么还用oligo来设计，只是借助这个软件让我们效率更高心里有底。同时推荐一个需要P 5000bp以上的酶，vazyme P515，延伸只需要2min，一共需要32个循环即可。