利用TCGA数据库分析胃癌HER-2基因状态与PD-L1表达的相关性及其临床意义

吕慧芳，孙克然，聂彩云，陈贝贝，徐伟锋，雷慧君，韩博涵，郭娟，吴妍，陈小兵*

郑州大学附属肿瘤医院    河南省肿瘤医院

摘要：众所周知，阻断PD-1/PD-L1通路可阻断肿瘤细胞免疫逃逸，促进T细胞活化，从而增强抗肿瘤效应。免疫检查点抑制剂在胃癌的治疗中取得了理想的效果，其疗效和 PD-L1表达程度密切相关，但PD-L1单独并不能作为预测免疫治疗的疗效，而PD-L1联合人类表皮生长因子受体2（HER2）状态可能更能预测免疫治疗的疗效。本研究的目的在于探讨PD-L1表达与HER2的相关性及可能的临床意义。 

方法：从癌症基因组图谱（TCGA）数据库收集胃癌数据集，下载HER2基因拷贝数，PD-L1基因表达谱资料及临床信息资料。分析PD-L1表达与胃癌HER2状态、临床病理学参数的相关性及对患者OS的影响。 

结果：胃癌患者HER2状态与PD-L1,CD8A表达有显著相关性。HER2阴性胃癌患者PD-L1+/CD8A+细胞比例为20.3%，而HER2阳性胃癌患者PD-L1-/CD8A-细胞比例为57.8%，提示HER2阳性患者单用免疫治疗效果差，联合治疗效果更佳。据HER2状态和 PD-L1表达分为四个亚群，HER2阴性/PD-L1低表达胃癌患者总生存期最长，HER2阳性/PD-L1高表达者总生存期最短，提示PD-L1的表达状态联合HER2状态可能预测胃癌患者的预后。 

结论：PD-L1的表达状态和HER2状态联合检测可能比单独的任何一个因素更有意义。

近十年来随着生物免疫治疗技术的发展与成熟，恶性肿瘤的治疗进入了新的阶段，但是对于晚期胃癌的患者来说，其预后并没有太大改观。据统计，2012年在世界范围内有723000人死于胃癌，由此胃癌已位列癌症相关死亡病例数的第四位^【1】。转移性胃腺癌的5年总生存率仅仅只有5-20%左右^【2】。人表皮生长因子受体-2（HER2，也称ERBB2）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，其过表达或过度表达于大约6.1%～23.0%的胃癌中^【3-5】。在乳腺癌中，HER2基因的扩增和过度表达与低预后、高死亡率、高复发和转移有关^【6-8】。然而，HER2在胃癌中的预后价值仍有争议。一些研究表明，HER2阳性患者生存率高^【9-11】，而其他研究表明，HER2的地位和生存率之间没有关系^{【4,12-14】}。大量文献表明，通过免疫组织化学（IHC）或荧光原位杂交（FISH）检测，HER2阳性与浆膜浸润、淋巴结转移、疾病分期或远处转移等临床病理特征的存活率和/或临床特征相关^{【11,15,16】}。

程序性细胞死亡-1（PD-1）与其配体程序性细胞死亡配体（PD-L1）与免疫细胞和肿瘤细胞的相互作用限制了T细胞介导的免疫应答^【17】。抗PD-1或抗PD-L1抗体的免疫检查点阻断是治疗多种癌症（包括非小细胞肺癌^【18-20】、黑色素瘤^【21】、膀胱癌^【22】和肾癌^【23】）的最新的治疗方法。在早期的临床研究中，PD-1抑制剂治疗转移性胃癌，例如帕博利珠单抗^【24】和纳武单抗^【25】就已经被报道出有很好的疗效。目前研究显示，肿瘤PD-L1的表达可以用来预测抗PD-1治疗的疗效^【26】，但并非只有PD-L1阳性的患者都有效，PD-L1阴性的患者也会有效。因此，我们需要寻找更加准确的预测疗效的分子指标。PD-L1表达状态和人表皮生长因子受体2（HER2）状态是胃癌患者的两个重要病理特征。但HER-2基因状态与PD-L1的表达之间的关系尚不明确。HER2在胃癌的预后价值仍有争议。对于HER2阴性的患者来说，PD-L1呈高表达状态。这两个因素之间的相互作用是什么？我们猜想将PD-L1的表达状态和人类表皮生长因子受体2（HER2）状态结合起来可能比单独的任何一个因素更有意义。本研究利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库收集胃癌数据集。从而分析PD-L1表达与胃癌HER2状态、临床病理学参数的相关性及对患者OS的影响，来探讨PD-L1表达与HER2基因的相关性以及可能的临床意义。

1材料与方法

1.1 数据资料收集  胃癌患者数据从TCGA数据库（https：//tcga⁃data.nci.nih.gov/tcga/）下载 并预处理胃癌数据集的mRNA表达RNASEqV2数据及HER2基因拷贝数。

1.2 数据集筛选和临床病理学参数相关性研究 仅保留TCGA数据集中包含临床参数和生存资料的病例。根据表达谱数据，根据样本的PD-L1及CD8A 表达中位数进行分组，低于中位数的样本为低表达组，高于中位数的样本为高表达组。

1.3 统计学方法 使用SPSS17.0软件进行统计学分析。临床病理参数相关性分析，组间比较采用χ2检验及Fisher 确切概率法，生存分析采用Kaplan⁃Meier和log⁃rank 检验法。P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 PD-L1表达与临床病理学相关性 在TCGA数据集中， PD-L1的表达与性别、年龄、TNM 分期无关；与分化程度明显相关（P=0.013），与HER2状态密切相关（ P=0.003），见表1。结果为肿瘤分化程度越低，PD-L1的表达程度越高，提示免疫治疗对于分化程度低的胃癌患者有效。

表1 基线特征

2.2 HER2基因扩增对PD-L1表达的影响

对TCGA数据库HER2基因扩增状态进行整理归类，并査找数据库的PD-L1 mRNA表达进行整理，分析不同HER2基因状态下PD-L1 mRNA表达水平。TCGA分析结果显示Her2阴性胃癌患者PD-L1高表达，而Her2阳性胃癌患者PD-L1表达下降（见图1）。结果提示免疫治疗对HER2阴性胃癌瘤患者更有效。

图1不同HER2基因状态下PD-L1 mRNA表达水平

2.3 HER2基因扩增对PD-L1/CD8阳性比例分布的相关性

既往研究根据PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞的不同表达组合分为4种不同免疫疫状态，包括PD-L1+/CD8A+, PD-L1+/CD8A-, PD-L1-/CD8A+及PD-L1-/CD8A-，而PD-L1+/CD8A+状态被认为是最适合免疫治疗的免疫状态。我们分析了HER2对PD-L1/CD8阳性比例分布的影响。TCGA表达谱数据显示HER2扩增患者PD-L1与CD8四种比例分布情况: PD-L1+/CD8A+, PD-L1+/CD8A-, PD-L1-/CD8A+及PD-L1-/CD8A-分别为：20.3%，12.5%，15.6%，57.8%；HER2阴性患者 PD-L1+/CD8A+, PD-L1+/CD8A-, PD-L1-/CD8A+及PD-L1-/CD8A-四种比例分别为：37.6%，16.4%，17.2%，28.8%（见图2， P<0.001）。结果提示HER2未扩增患者相较于HER2扩增患者PD-L1/CD8双阳性比例显著增加，而HER2扩增患者PD-L1/CD8双阴性性比例最高。该结果进一步提示免疫治疗对于HER2阴性胃癌患者可能更有效， HER2阳性胃癌患者预后差，单用免疫治疗效果差，更强的联合治疗方案可能才会有效，例如免疫治疗联合抗HER2

治疗。

图2  PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞的不同表达组合区分为4种不同兔疫状态

2.4 HER2扩增及PD-L1表达情况对胃癌OS影响

根据HER2状态和 PD-L1表达将胃癌患者分为四个亚群（分别为HER2 amp，PD-L1 pos；HER2 amp，PD-L1 neg；HER2 neg，PD-L1 pos及HER2 neg，PD-L1 neg），患者的比例分别为6.21%、12.72%、43.79%和37.28%。中位生存期分别为18.3， 26.7、24.2及32.2个月（p<0.001；图4）。IV期患者生存中位生存期分别为7.6个月、10.5个月、10.6个月和14.0个月(P=0.001)。结果显示，HER2阴性/PD-L1低表达胃癌患者总生存期最长，HER2阳性/PD-L1高表达者总生存期最短。由此结果我们可以提出猜想PD-L1的表达状态联合HER2状态可能预测胃癌患者的预后。

图3 HER2扩增及PD-L1表达情况对胃癌OS影响

备注：1代表HER2 amp，PD-L1 pos；2代表HER2 amp，PD-L1 neg；3代表HER2 neg，PD-L1 pos；4代表HER2 neg，PD-L1 neg

3讨论

2013年研究^【27】发现，单用曲妥珠单抗对单一培养的HER2过表达人乳腺癌细胞中PD-L1的表达水平无影响，但HER2过表达乳腺癌细胞和人外周血单核细胞共培养时，应用曲妥珠单抗后，PD-L1表达上调，提示曲妥珠单抗介导的免疫细胞参与的PD-L1表达上调可能是曲妥珠单抗耐药的一个潜在机制。PD-L1的表达水平与Her-2的表达状态之间的联系是目前重点的研究对象以及研究方向。经研究PD-L1表达与临床病理学相关性在TCGA数据集中， PD-L1的表达与性别、年龄、TNM 分期无关；与分化程度明显相关，与HER2状态密切相关，提示肿瘤分化程度越低，PD-L1表达程度越高，进一步提示免疫治疗对于分化程度更低的肿瘤患者可能更有效。经分析不同HER2基因状态下PD-L1 mRNA表达水平，得知HER2阴性胃癌患者PD-L1高表达，提示免疫治疗对于HER2阴性的肿瘤患者可能更有效，HER2阳性胃癌患者联合治疗效果更佳。接着我们又分析了HER2对PD-L1/CD8阳性比例分布的影响。TCGA表达谱数据显示HER2扩增患者PD-L1+/CD8A+及PD-L1-/CD8A-分别为20.3%，57.8%；HER2阴性患者 PD-L1+/CD8A+及PD-L1-/CD8A-四种比例分别为37.6%， 28.8%，再次证明了免疫治疗对于HER2阴性的肿瘤患者来说可能会更有效，而对于HER2阳性患者来说，更强的治疗方案可能才会有效。我们又根据HER2状态和 PD-L1表达分为四个亚群对其OS进行分析，提示HER2阴性/PD-L1低表达胃癌患者总生存期最长，HER2阳性/PD-L1高表达者总生存期最短，提示PD-L1的表达状态联合HER2状态可能预测胃癌患者的预后。由此我们可以提出猜想PD-L1的表达状态和HER2状态联合检测可能比单独的任何一个因素更有意义。

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